西兰花浙青80的高效制种与纯度鉴定技术

王建升，沈钰森，虞慧芳，盛小光，赵辉，黄志勇，马存发，武婷，顾宏辉*

(1.浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021；2.浙江美之奥种业股份有限公司，浙江 嘉兴 314000)

西兰花是十字花科芸薹属甘蓝类蔬菜，因花球中含有多种芥子油苷组分，特别是萝卜硫苷而备受关注[1]。我国是世界上最大的西兰花生产国、出口国和消费国，种植面积超过8.71 万hm2[2]。长期以来，日本、美国等国外公司品种垄断国内西兰花市场，西兰花种业“卡脖子”问题严峻。2018年农业农村部启动了西兰花国家良种重大科研联合攻关项目[3]。2022年1月根据国家西兰花良种攻关组统计，国内品种市场占有率已从原来的10%提高到25%左右。国内科研单位和种业公司联合攻关，育成了一系列具有进口替代潜力的品种[2,4]。然而，在西兰花制种过程中，普遍存在制种产量低、成本高等问题，国产西兰花品种产量难以满足市场需求。

目前，国内外西兰花商品种主要采用Ogura不育源的雄性不育系制种，不育率可以达到100%[2]，但是仍然存在串粉、机械混杂、亲本混有杂株等问题，从而影响杂交种纯度。目前分子标记检测技术已经广泛应用于作物种子的纯度鉴定，其中KASP标记技术是由英国 LGC公司开发的新一代高通量自动化 SNP检测技术，具有共显性,显示 DNA 序列差异，易实现数据整合共享、通量高、单位点检测成本低等优点，现已成为国际上SNP分型以及插入缺失变异检测的主要方法之一，并在水稻等作物中已得到了大量应用[5-6]。

浙青80(浙认蔬2019001)是浙江省农业科学院蔬菜研究所于2019年育成的西兰花新品种[7]，具有花球高圆、蕾粒匀细、低温不易发紫等优点，花球商品性好，已连续2年被浙江省农业农村厅推介为农业主导品种，可替代进口的中晚熟品种。为满足市场需求，加快西兰花国产化进程，本研究在先前制种经验基础上，根据浙青80父母本的特征特性，开展了浙青80的播种期、父母本比例、疏球整枝等大棚制种技术研究，实现了我国西兰花雄性不育系杂交制种产量的历史突破；同时，建立了浙青80高通量、低成本的KASP分子标记纯度鉴定技术，为我国西兰花杂交制种和种子纯度快速鉴定提供了重要参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以浙江省农业科学院蔬菜研究所育成的浙青80的父母本为材料，母本为Ougra雄性不育系，父本为双单倍体材料，本试验于 2020—2021年在浙江省农业科学院杨渡基地进行。

1.2 制种方法

1.2.1 主要栽培管理

试验大棚长40 m，宽8 m，共5畦，每畦定植2行，株距45 cm，行距约50 cm。疏球整枝前的肥水管理、病虫害防治、移栽条件等方法参考先前西兰花栽培技术[8]，疏球整枝后施45%复合肥一次，每个大棚约10 kg，并化学防治病虫害。花期采用熊蜂授粉，每个大棚2箱，每箱约100只。授粉结束后，及时清理病残枝叶、化学防治病虫。

1.2.2 播种期试验

花期父母本同时播种，播种期为8月15日(播种期1)、8月25日(播种期2)和9月5日3个播种期(播种期3)。

1.2.3 种植比例试验

根据以往经验和文献报道[9]，本试验中选择2个父母本比例，父母本种植比例2∶3(比例1)，父母本比例为1∶4(比例2)。

1.2.4 疏球整枝方式试验

由于母本侧枝极少，选择对主花球采用2种疏球整枝方式，疏球整枝方式为保留1个小球(疏球1)或两个小球(疏球2)。

1.2.5 性状测量与数据统计分析

每个处理随机选取10株，考察单株枝条数、单株角果数、每角果粒数(统计10个枝条)和大棚实际产量，种子完全收获后测定千粒重。用 Excel 2010 软件进行数据统计，并通过SPSS16.0软件进行方差分析和多重比较(ANOVAP<0.05,Duncan’s test)。

1.3 杂交种KASP标记开发与纯度鉴定

1.3.1 KASP标记开发

根据先前西兰花指纹图谱库数据中的100个SNP位点[10]，我们筛选出浙青80父母本的3个特异SNP位点，设计了特异的KASP引物(表1)。

1.3.2 杂交种子纯度鉴定

种子发芽10 d以后即可提取待测浙青80的基因组DNA，以提取的DNA为模板，加入特异的引物混合液和通用的KASP预混合液(通用的FRET cassette荧光引物，ROX内参染料，Klear Taq DNA聚合酶，dNTP和MgCl2)，PCR的反应体系为：KASP预混合液5 μL;引物混合液0.14 μL；其中各引物的终浓度均为5 nmol·L-1；20 ng·μL-1模板DNA 5 μL；采用PCR的反应条件为：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性20 s，61～55 ℃退火延伸60 s，每个循环的退火温度降低0.6 ℃，共10个循环；94 ℃变性20 s，55 ℃退火延伸60 s，共26个循环。最后采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。

表1 用于检测3个SNP位点的KASP引物信息及检测基因型

每个大棚随机取89株，并加入2株父本，2株母本，2个对照品种(炎秀、绿雄90)和水为阴性对照，根据基因分型结果(图1)，判定待测样本为亲本、杂交种或异型株。统计亲本、杂交种和异型株的数目，计算浙青80的种子纯度。

2 结果与分析

2.1 不同因素对制种产量及产量性状的影响

播种期在8月25日、父母本比例为1∶4、疏球方式为2时，折合制种每667 m2产量最高为50.67 kg。实际最高制种每667 m2产量为33.35 kg，其播种期也是在8月25日，并采用疏球2方式整枝，父母本比例为2∶3(表2)。

单株枝条数分析结果表明，采用播种期2、父母本比例2、疏球2组合方式时母本的单株枝条数最多，达到83.36个。播种期和父母本比例相同条件下，疏球2的单株枝条数显著高于疏球1数量，这表明疏球方式对单株枝条数的多少有重要的作用，而且与播种期和比例无关。播种期和疏球方式相同条件下，比例1和比例2之间的单株枝条数差异不显著，表明父母本比例对单株枝条数没有显著影响。疏球方式和父母本比例相同条件下，疏球2、父母本比例1方式下的单株枝条数为播种期2显著高于播种期3，但播种期1和播种期3无显著差异；疏球1、父母本比例2方式下的3个播种期之间均存在显著差异；疏球2、父母本比例2方式下的播种期2均显著高于播种期1和播种期3，这表明播种期对单株枝条数的多少有影响，而且这种影响与疏球方式和父母本比例有关。

单株角果数分析结果表明，播种期2、父母本比例1、疏球2时最多，播种期2、父母本比例2、疏球2次之。播种期和父母本比例相同条件下，疏球2较疏球1方式的单株角果数更多，除了播种期1、父母本比例2组合种植管理方式下2种疏球方式的单株角果数没有显著差异，其他条件的2种疏球方式均存在显著差异，这表明多数情况下，疏球2相对疏球1能够提高单株角果数。播种期和疏球方式相同条件下，只有播种期2、疏球2组合方式种植比例1与比例2的单株角果数存在显著差异，其他比例1和比例2的单株角果数均没有显著差异。而比例和疏球方式相同条件下，播种期2的单株角果数最多，但只有播种期2、疏球2、父母本比例1和播种期2、疏球2、父母本比例2显著高于播种期1和播种期3的单株角果数，这表明播种期对单株角果数的影响受限于特定疏球方式，但与父母本比例无关。

表2 播种期、父母本比例、疏球整枝方式对浙青80制种产量及产量相关性状的影响

每角果粒数和千粒重的分析结果表明，每角果粒数和千粒重在不同方法之间均没有显著差异，暗示当前的制种方式没有影响每角果粒数和千粒重，也不是造成产量差异的主要因素。

2.2 纯度检测结果

收获的浙青80杂交种与亲本以及3个阴性对照利用SNP8 001、SNP8 002和SNP8 003 SNP标记进行KASP基因分型检测。结果表明，杂交种的基因分型结果分别为GA、CG、CT，父本分别为GG、CC和CC，母本分别为AA、GG和TT(图1)，不同大棚中的杂交种纯度均为100%。

A—引物SNP8 001；B—引物SNP8 002；C—SNP8 003；左上角小圆圈为加入的父本样品，右下角小圆圈为母本样品，中间小圆圈为杂交种，左下角灰色、黑色小圆圈为水和对照样品。图1 浙青80杂交种KASP基因分型结果

3 讨论

目前，国内外西兰花制种主要采用Ogura不育源的细胞质雄性不育系杂交制种方式，国内商品种也以雄性不育杂交种为主[1,9,11-12]。总体来看，浙青80制种的适宜播种期在8月25日，采用主球保留2个小球的疏球方式，而父母本的比例可以采用2∶3，也可以1∶4，实际制种每667 m2产量分别达到33.35和31.02 kg。根据先前报道，自交不亲和制种每667 m2产量在25.7～25.9 kg[11]，雄性不育制种产量在15～30 kg[1,9]，浙青80的制种产量明显高于先前品种的产量，其原因可能是多方面的，主要包括遗传因素、天气(尤其是开花期间)、栽培方法、蜜蜂等，而浙青80是否能够达到高产和稳产还需要进一步研究。

我们的研究表明，播种期是影响制种的关键因素，由于浙青80父本花期略早母本3～5 d，所以在制种时选择同时播种，但是开花的时间和植株的发育会受到播种期的影响，提前播种会导致花期提前，我们推测由于开花前期温度低，不适宜蜜蜂活动和授粉受精，从而导致制种产量偏低；播种延后则植株长势偏弱小，枝条数偏少且花期短，最终也会影响制种的产量。

父母本比例也是西兰花制种中的重要因素，由于西兰花采用的是雄性不育制种，杂交种由母本上收获，适当增加母本的量是常用的措施，先前檀国印等[9]对台绿1号的父母本制种比例为1∶2或1∶1。由于浙青80父本花期长、花粉量大，我们采用了2∶3和1∶4比例进行试验，单从最适播种期且采用疏球2方式来看，比例对枝条数没有显著影响，但对角果数有影响，所以尽管采用1∶4的父母本比例增加了母本的植株数量，但并没有增加产量，推测可能是父本量减少，导致花粉量不足，因此，最终单株角果数显著降低。但从最终产量来看，2种比例对浙青80制种产量的影响不大。

花球高圆紧实是近年来西兰花育种的主要目标之一[7]，其制种亲本往往也多表现高花球圆紧实，然而高圆紧实型的花球常表现抽薹短或者细，开花和角果的数量少，西兰花疏球整枝是促进抽枝、增加枝条数量和质量的常用手段[9,11]。由于浙青80母本侧枝极少，因此，不适合割除整个主球保留侧枝的方式制种，我们选择了保留主球的2个小花球和1个小花球2种疏球方式，保留2个小花球的枝条数、角果数、产量均高于保留1个小花球。

基于前期具有代表性的西兰花材料的指纹图谱数据[10]，利用高通量的KASP基因分型平台，对100个SNP位点进行筛选，根据多态性指数、最小等位基因频率、基因分型的质量、结果的重复性等指标，筛选出适用于浙青80种子纯度鉴定的3个SNP位点，并设计出用于检测SNP位点的共9条引物序列。利用这9条引物序列，有效区分了亲本和对照材料，实现了种子纯度和种子真伪的同时鉴别，而且后期田间的表型鉴定也验证了其可靠性。本研究中KASP检测方法采用的是96孔板可视化检测，具有检测通量高、成本低的特点。

国内育种单位育成品种各有其特征，我们认为西兰花制种中需要根据父母本的特征特性制定合适的制种方案，包括播种期、疏球整枝方式、父母本比例、种植密度等。另外，未来西兰花育种时也要将杂交亲和性作为一项重要指标，从而为制种奠定良好的遗传基础。