张迪,王应辉,薛瑾,陈应强
1 贵州医科大学感染科教研室,贵阳 550004;2 黔南州人民医院医学检验科;3 贵州医科大学第三附属医院感染科
肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展过程中的重要环节,其主要病理改变是细胞外基质(ECM)大量形成并在肝脏内沉积[1-2]。肝星状细胞是ECM的主要来源。正常情况下,肝星状细胞处于静止状态,不合成或合成少量ECM。当肝星状细胞被激活后可转化为肌成纤维细胞样细胞,从而大量合成ECM[3]。目前,肝纤维化的具体发病机制尚未完全阐明。NF-κB信号通路是一条至关重要的炎症信号通路。有研究表明,阻断NF-κB 信号通路可减少下游炎症因子释放,抑制肝星状细胞激活,减少ECM合成和沉积,从而抑制肝纤维化[4]。都匀毛尖茶是我国的十大名茶之一,含有丰富的蛋白质、氨基酸、生物碱、茶多酚等物质。其中,茶多酚的含量约占17%[5]。有研究报道,茶多酚可降低血浆和肝脏组织炎症因子水平,提高肝脏的抗炎能力[6]。2021年1月—2022年1月,本研究探讨了都匀毛尖茶浸提液对人肝星状细胞增殖的影响及其机制。现报告如下。
1.1 材料 人肝星状细胞株LX-2,购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。特级都匀毛尖茶,购自贵州省黔南州梅渊商贸有限公司。水飞蓟宾,购自北京索莱宝科技有限公司。所有引物序列购自美国Thermo Fisher Scientific公司。iMARKTM酶标仪,购自美国Bio-Rad 公司;Veriti PCR 仪,购自美国Thermo Fisher Scientific 公司;化学发光成像系统,购自上海勤翔科学仪器有限公司。CCK-8 试剂盒,购自北京博奥森生物技术有限公司;总RNA 提取试剂盒,购自美国OMEGA 公司;Hifair®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Hieff UNICON®Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix,购自上海翊圣生物科技有限公司;Western 一抗、二抗稀释液,购自上海碧云天生物科技有限公司;NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα 一抗,购自美国CST 公司;IL-6、COX-2 一抗,购自武汉三鹰生物技术有限公司;TNF-α 一抗,购自美国Affinity公司;GAPDH 单克隆抗体,购自杭州贤至生物科技有限公司;HRP 标记的羊抗兔IgG 二抗,购自武汉普美克生物技术有限公司。
1.2 细胞培养 将LX-2 细胞接种于含10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基,置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。待细胞贴壁生长达80%融合后,用0.25%胰蛋白酶消化,按1∶3传代。取传6代、对数生长期、生长状态良好的LX-2细胞进行后续实验。
1.3 都匀毛尖茶浸提液制备 取特级都匀毛尖茶10 g,研磨后加入无水乙醇和去离子水混合液(体积比2∶1)150 mL,63 ℃水浴超声30 min,过滤去渣,获得都匀毛尖茶浸提液原液。将都匀毛尖茶浸提液原液置于旋转蒸发仪真空泵中,50 ℃蒸发无水乙醇,65 ℃蒸发剩余水分,获得都匀毛尖茶干粉约5 g,用时经0.22 μm微孔过滤器过滤除菌后稀释至相应浓度。1.4 LX-2 细胞活性检测 采用CCK-8 法。取传6代、对数生长期、生长状态良好的LX-2细胞,接种于96孔板,置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养24 h。待细胞贴壁生长至80%融合时,分别加入5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL都匀毛尖茶浸提液10 μL,另设空白对照孔和阴性对照孔,每个浓度设6 个复孔。继续培养24 h,每孔加入CCK-8溶液10 μL,37 ℃孵育2 h。酶标仪于450 nm 波长处检测各孔的光密度(OD)值,按公式计算细胞活性。细胞活性=(实验孔OD450值-空白对照孔OD450值)/(阴性对照孔OD450值-空白对照孔OD450值)×100%。计算LX-2 细胞半数抑制活性(IC50)时都匀毛尖茶浸提液浓度,选择低于LX-2 细胞IC50时都匀毛尖茶浸提液浓度进行后续实验。
1.5 细胞分组干预 取传6 代、对数生长期、生长状态良好的LX-2 细胞,随机分为空白对照组、模型组以及茶浸提液低、中、高浓度组和阳性对照组。空白对照组不予任何处理,常规培养26 h;模型组予0.5 μg/mL 脂多糖(LPS)预处理2 h 后常规培养24 h;茶浸提液低、中、高浓度组予0.5 μg/mL LPS 预处理2 h 后分别加入低、中、高浓度都匀毛尖茶浸提液处理24 h;阳性对照组予0.5 μg/mL LPS 预处理2 h 后加入5 μmol/L 水飞蓟宾处理24 h。
1.6 炎症因子基因表达检测 采用RT-qPCR 法。收集各组干预后LX-2 细胞,按总RNA 提取试剂盒说明提取细胞总RNA,经NanoDrop 2000 超微量分光光度计鉴定,OD260/OD280为1.8~2.0。按Hifair®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明将总RNA 逆转录为cDNA。以cDNA 为模板,按Hieff UNICON®Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 说明进行PCR 扩增。引物序列:IL-6 上游引物5′-GGCACTGGCAGAAAACAACC-3′、下游引物5′-GGCAAGTCTCCTCATTGAATCC-3′,TNF-α 上游引物5′-GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3′、下游引物5′-GCTTGAGGGTTTGCTACAACA-3′,COX-2 上游引物5′-TTCCAATCCATGTCAAAACCGT-3′、下游引物5′-AGTCCGGGTACAGTCACACTT-3′,GAPDH 上游引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′、下游引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。PCR 反应体系共20 μL:Hieff UNICON®Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL,cDNA模板4 μL,ddH2O 5.2 μL;反应条件:95 ℃ 2 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 共40 个循环。PCR 反应结束,绘制熔解曲线,收集循环阈值(CT)数。以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。
1.7 炎症因子及NF-κB信号通路蛋白表达检测 采用Western blotting 法。收集各组干预后LX-2 细胞,加入含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA 裂解液提取细胞总蛋白,经BCA 法蛋白定量合格。然后加入蛋白上样缓冲液,置于金属恒温孵育器100 ℃加热变性10 min。取部分变性蛋白,SDS-PAGE 分离。电泳结束,将蛋白电泳产物转印至PVDF 膜上。5%脱脂奶粉封闭,然后分别加入IL-6、TNF-α、COX-2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、GAPDH 一抗,4 ℃孵育过夜。次日,加入HRP 标记的羊抗兔IgG 二抗,室温孵育1 h。ECL 发光,在化学发光成像系统中曝光、显影。采用一体式化学发光成像系统采集图像,Image J 软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH 为内参,以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。
1.8 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0统计软件。计量资料经正态性检验和方差齐性检验符合正态分布,以±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1 都匀毛尖茶浸提液浓度筛选 0、5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL 都匀毛尖茶浸提液干预24 h,LX-2 细胞活性分别为0.854 ± 0.112、0.839 ±0.075、0.803 ± 0.072、0.762 ± 0.049、0.727 ±0.016、0.673 ± 0.016、0.603 ± 0.041、0.501 ±0.009、0.306 ± 0.025。都匀毛尖茶浸提液呈浓度依赖性抑制LX-2 细胞活性(F=60.160,P<0.01)。5、10、20 μg/mL 都匀毛尖茶浸提液干预时LX-2 细胞活性虽然呈下降趋势,但与0 μg/mL 都匀毛尖茶浸提液干预时比较P均>0.05;而40、80、160、320、640 μg/mL 都匀毛尖茶浸提液干预时LX-2 细胞活性明显下降,与0 μg/mL 都匀毛尖茶浸提液干预时比较P均<0.05。通过GraphPad Prism 8.0 软件计算,LX-2 细胞IC50时都匀毛尖茶浸提液浓度为170.9 μg/mL。因此,选择40、80、160 μg/mL 都匀毛尖茶浸提液分别作为茶浸提液低、中、高浓度组进行后续实验。
2.2 各组IL-6、TNF-α、COX-2表达比较 见表1。
表1 各组IL-6、TNF-α、COX-2表达比较(±s)
表1 各组IL-6、TNF-α、COX-2表达比较(±s)
注:与空白对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与茶浸提液低浓度组比较,△P<0.05;与茶浸提液中浓度组比较,▲P<0.05;与茶浸提液高浓度组比较,▽P<0.05。
组别空白对照组模型组茶浸提液低浓度组茶浸提液中浓度组茶浸提液高浓度组阳性对照组IL-6 mRNA 1.00 ± 0.00 3.16 ± 0.10*2.73 ± 0.11*#2.02 ± 0.10*#△1.68 ± 0.11*#△▲0.86 ± 0.08#△▲▽蛋白0.79 ± 0.14 1.05 ± 0.09*0.74 ± 0.04#0.51 ± 0.02*#△0.29 ± 0.02*#△▲0.29 ± 0.02*#△▲TNF-α mRNA 1.00 ± 0.03 3.74 ± 0.43*2.60 ± 0.13*#2.30 ± 0.12*#1.28 ± 0.09#△▲0.75 ± 0.12#△▲蛋白0.50 ± 0.05 1.42 ± 0.06*1.00 ± 0.05*#0.44 ± 0.03#△0.23 ± 0.05*#△▲0.19 ± 0.02*#△▲COX-2 mRNA 1.00 ± 0.19 6.46 ± 0.23*4.64 ± 0.56*#3.71 ± 0.30*#2.80 ± 0.15*#△2.81 ± 0.48*#△蛋白0.71 ± 0.07 1.08 ± 0.05*0.66 ± 0.05#0.46 ± 0.06*#△0.27 ± 0.04*#△▲0.32 ± 0.02*#△▲
2.3 各组NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表达比较 见表2。
表2 各组NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表达比较(±s)
表2 各组NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表达比较(±s)
注:与空白对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与茶浸提液低浓度组比较,△P<0.05;与茶浸提液中浓度组比较,▲P<0.05;与茶浸提液高浓度组比较,▽P<0.05。
p-IκBα 1.18 ± 0.02 1.32 ± 0.03*0.98 ± 0.06*#0.89 ± 0.03*#0.74 ± 0.04*#△▲0.65 ± 0.04*#△▲组别空白对照组模型组茶浸提液低浓度组茶浸提液中浓度组茶浸提液高浓度组阳性对照组NF-κB p65 1.12 ± 0.01 1.03 ± 0.01*1.00 ± 0.01*1.02 ± 0.01*1.05 ± 0.03*1.03 ± 0.02*p-NF-κB p65 0.87 ± 0.10 1.20 ± 0.01*0.97 ± 0.06#0.87 ± 0.07#0.64 ± 0.02*#△▲0.50 ± 0.02*#△▲IκBα 0.76 ± 0.02 0.82 ± 0.04 0.73 ± 0.01 0.76 ± 0.03 0.77 ± 0.03 0.82 ± 0.05
肝纤维化是由各种致病因素导致肝内结缔组织异常增生的病理生理过程,是慢性肝病向肝硬化进展的共同环节。迄今为止,肝纤维化的发病机制仍未完全阐明,临床尚无有效治疗肝纤维化的化学药物。近年来,随着国民健康意识不断加强以及生活水平不断提高,国内食品、医药、保健品等行业正朝着绿色、天然、无污染方向不断转型升级,天然植物及其提取物在疾病防治方面备受关注[7-8]。
茶叶是天然的植物饮品,也是全球第二大饮品。都匀毛尖茶是我国的十大名茶之一,含有丰富的蛋白质、氨基酸、生物碱、茶多酚等物质。其中,茶多酚的含量约占17%[5]。表没食子儿茶素没食子酸酯是茶多酚中最有效的活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用,能够抑制氧化损伤,通过减少Ⅰ型胶原合成、抑制细胞增殖及基质金属蛋白酶活化,抑制肝星状细胞侵袭并诱导肝星状细胞凋亡,从而发挥抗肝纤维化作用[9-10]。本研究结果发现,都匀毛尖茶浸提液呈浓度依赖性抑制LX-2 细胞活性,提示都匀毛尖茶浸提液能够抑制肝纤维化。但目前都匀毛尖茶浸提液抑制肝纤维化的机制尚不清楚。
IL-6 是一种重要的炎症因子,可由活化的肝星状细胞分泌,而IL-6 增多又可进一步刺激肝星状细胞增殖,使肝星状细胞处于持续活化状态。因此,IL-6 是肝星状细胞活化的重要标志之一[11]。另外,当肝脏存在活动性炎症时,肝细胞可分泌炎症因子IL-6、TNF-α、COX-2,这些炎症因子又可加重肝细胞炎症反应,进一步加重肝损伤,从而导致肝纤维化发生[12]。因此,IL-6、TNF-α、COX-2是反映肝细胞炎症的重要介质。本研究通过GraphPad Prism 8.0软件计算,LX-2 细胞IC50时都匀毛尖茶浸提液浓度为170.9 μg/mL。因此,选择40、80、160 μg/mL都匀毛尖茶浸提液分别作为茶浸提液低、中、高浓度组进行后续实验。结果发现,LX-2细胞经40、80、160 μg/mL都匀毛尖茶浸提液干预后,LX-2 细胞活性均显著降低,这表明都匀毛尖茶浸提液可抑制LX-2 细胞活性,具有一定抗肝纤维化作用。本研究结果发现,与空白对照组比较,模型组IL-6、TNF-α、COX-2 mRNA 和蛋白表达均显著升高;与模型组比较,茶浸提液低、中、高浓度组IL-6、TNF-α、COX-2 mRNA 和蛋白表达均显著降低,尤其是茶浸提液高浓度组效果甚至与阳性对照组相当。结果提示,都匀毛尖茶浸提液可通过抑制炎症因子表达来减轻肝脏炎症反应,从而抑制肝纤维化发生。
NF-κB是由Rel、p65、RelB、p50、p52五个亚单位聚合形成的同源或异源二聚体。NF-κB可通过与细胞核内特异性κB 序列结合,诱导相关基因转录,进而参与肝脏炎症损伤,促进肝纤维化发生[13]。IκBα是最具特异性的NF-κB 抑制剂,可通过其锚蛋白重复序列与RHD 结合而掩盖NF-κB 的核定位信号,阻止NF-κB 转位进入细胞核内调控基因的转录与表达。磷酸化的IκBα 被泛素结合酶识别发生快速泛素化并迅速被蛋白酶体降解,从而提高NF-κB 的入核效率,导致NF-κB 活化[14]。有研究报道,槲皮素、丹参素等天然黄酮类成分可通过抑制IκBα 磷酸化和降解来抑制NF-κB 活化,下调IL-6、TNF-α、COX-2等炎症因子表达,从而抑制肝纤维化发生[15-16]。本研究结果显示,与空白对照组比较,模型组p-NF-κB p65、p-IκBα 蛋白表达显著升高;与模型组比较,茶浸提液低、中、高浓度组p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表达显著降低,尤其是茶浸提液高浓度组效果甚至与阳性对照组相当。结果提示,都匀毛尖茶浸提液能够抑制NF-κB信号通路活化。
综上所述,都匀毛尖茶浸提液能够抑制人肝星状细胞增殖,其机制可能与抑制NF-κB 信号通路活化而减少炎症因子产生有关。但本研究仅通过体外细胞实验进行初步探究,尚需在体内进一步验证都匀毛尖茶浸提液的抗肝纤维化作用及其机制。