杜泊羊连续超数排卵间隔时间对排卵效果的影响

付 乐，于 涛，徐振朋，陈大勇，何辉杰，仇春娟，王秀莲，张泽文

（1.乌兰察布市农林科学研究所，内蒙古乌兰察布 012000；2.内蒙古赛诺种羊科技有限公司，内蒙古乌兰察布 012000；3.乌兰察布市畜牧工作站，内蒙古乌兰察布 012000；4.凉城县六苏木镇人民政府，内蒙古乌兰察布 013750）

内蒙古地区肉羊存栏量、产肉量常年居全国前列，多年来形成具有蒙古羊血统的多个优质肉羊品种，为了加快利用引进品种改良本地品种的生长速度及产肉性能等性状，以超数排卵与胚胎移植技术（multiple ovulation and embryo transfer，MOET)为核心的现代化生物繁育技术是一条高效途径，并已成为扩繁良种和保护濒危物种的有力辅助技术[1,2]。其中，超数排卵是胚胎移植等胚胎生物工程技术的重要环节，其目的是通过对动物注射外源性促性腺激素尽可能地收获更多胚胎，诱导胚胎移植或者使怀胎数量达到最大，提高优良母畜的繁殖能力，从而可以在短时期内大幅度地增加优良个体母畜和公畜的后代数量，迅速扩大良种畜群，加速育种和品种改良工作[3,4]。在肉羊胚胎移植中，超数排卵的效果直接影响肉羊胚胎移植的成败。影响超排的因素分为动物因素和环境因素，动物因素主要包括个体的遗传特性（品种)、年龄、生理状态、营养状况等，环境因素则包括外源性激素（质量、用量、方案)、季节、连续处理的间隔等[5,6]。有研究指出激素制剂中FSH/LH（促卵泡激素/促黄体素)比例、给药途径、剂量和频率等不同，肉羊个体对超排处理的反应也不同，具体影响程度和变化都需进一步研究。因此，在胚胎移植产业化生产中不断地摸索与研究各种内源因素与外源因素对胚胎移植效果的影响，发现不同影响因素对超数排卵的作用，进而完善改进超数排卵技术方案，对提高单只羊的出胚率和胚胎移植效率，降低胚胎生产损失，加速生产性能改良，提高肉羊生产的经济效益有重要意义。超排过程中外源激素和手术等因素的刺激使供体的重复利用受到了限制，因此，如何减少重复超排过程中对供体的刺激与损伤，提高重复超排的有效率，最大限度地利用优秀供体的繁殖机能，是做胚胎移植技术产业化特别关注的研究领域，也是行业今后研究的一个重点方向。本试验以杜泊绵羊为研究对象，初步探索研究连续超排次数、重复超排时间间隔对供体母羊排卵效果的影响，为胚胎移植产业化合理安排生产、降低生产成本并提高效率以及科学利用引进品种肉羊改良本土品种提供参考。

1 试验材料

1.1 试验动物

本试验供体羊来自四子王旗查干补力格苏木巴音嘎查赛诺种羊场的纯种杜泊母羊，年龄1.5 周岁左右，临床健康，生殖器官无异常供体母羊60 只，体重均为55～60kg。供体公羊为公司种公羊特一级纯种杜泊。试验于2018 年6 月—2019 年12 月进行。

1.2 试验药品

孕酮海绵栓孕酮（CIDR)由新西兰辉瑞公司生产；孕马血清促性腺激素（PMSG)为内蒙古松山兽药厂生产；促卵泡激素（FSH)、氯前列烯醇钠（PG)为上海计划生育生物研究所生产；促黄体素（LH)为宁波第一激素厂生产；体外培养试剂除特殊标注外皆由Sigma 公司生产。

2 方法

2.1 试验分组

本试验供体羊共计60 只，试验分为3 组，每组20 只，分别为间隔60d 组、间隔90d 组、间隔120d组。分别间隔每60、90、120d 超排一次，连续超排4次，重复超排母羊不变，试验过程中对输卵管严重粘连的母羊，下次超排时剔除不用，让其自然繁殖。

2.2 超数排卵和配种处理方法

所选择的供体母羊在同一日早上7:00 放入阴道海绵栓1 枚，同时配置有润滑剂与土霉素源粉，在放置海绵栓的第10d 晚上7:00 开始超数排卵（开始放栓第一天为0d)，用连续递减超排法，超排3d 注射FSH共计6 次，每天2 次，间隔12h 给药一次，在注射FSH 第5 次时去掉海绵栓，用400IU 青霉素混合500mL 生理盐水，每只羊10mL 冲洗阴道，并同时注射PG 1mL/只，第13 天试验羊只空腹24h，第14 天上午用试情公羊试情，发情母羊立即注射LH 280IU/只，并选用配种公羊进行配种，采用腹腔镜输精法在子宫角处输精，每只羊0.4mL（两侧各0.2mL)，精液稀释至2～4 倍。

2.3 胚胎收集

在供体羊发情后36～48h 从输卵管收集胚胎。手术前空腹24h，可以少量饮水，供体羊视体重而定，每千克体重肌注0.03～0.05mL 2%静松灵；局部注射盐酸利多卡因2.5mL/只。将母羊放到手术架上仰卧保定。在供体羊离乳房前端约2cm 处，腹中线的两侧均可，用手术刀将手术部位纵向切开6～8cm 长的刀口，用6～8#头皮针从子宫输卵管接合部的子宫端导入到输卵管峡部，将导卵管从输卵管喇叭口插入3～4cm，导卵管远端与玻璃平皿相接，将5mL 冲胚液缓缓推出，胚胎即通过输卵管回收于玻璃平皿中。另一侧操作同上。把盛有冲胚回收液的玻璃皿放在立体显微镜下，仔细检查，不可遗漏，将检出的胚胎放入盛有保存液的培养皿中，待移植，冲胚完毕后，在子宫角和输卵管处涂抹适量的普鲁卡因青霉素，用30～35℃的生理盐水将子宫和卵巢冲洗干净，将250mL 的甲硝唑灌入腹腔。供、受体母羊创口采用三层缝合法。腹膜、肌肉和皮肤分层缝合。每缝好一层涂抹适量青链霉素溶液，以防创口感染。手术后供体母羊再进行输液加强护理。

2.4 饲养管理

所有的供体母羊及种公羊，全部为放牧+舍饲，每天按照放牧时间放牧并根据营养标准给足量精补料和苜蓿，提供充足的清洁饮水，防疫、驱虫、药浴每年春秋各进行一次。

2.5 数据处理与分析

所有数据使用SPSS 12.0 统计软件的t 检验方法，以平均数±标准误表示。

3 结果与分析

3.1 时间间隔60d 连续超排结果

当供体母羊连续超排间隔60d 时，随着超排次数的增加，处理供体数量减少，其中第3 次超排淘汰的2 只供体母羊与第4 次超排淘汰的1 只供体母羊，均为输卵管粘连严重，淘汰出试验组，每次处理供体羊均100%发情受孕。随着超排次数的增加，回收胚胎数量和可用胚胎数量呈逐渐下降趋势，组内各次，回收胚胎数量和可用胚胎数量相比较下降显著（P＜0.05)；受体羊两侧排卵点，随着超排次数的增加，呈逐渐下降趋势，每一次超排后的排卵点与前一次相比较差异显著（P＜0.05)。平均每次每只供体羊能够出胚胎数6.1，排卵点为11.23 个（表1)。

表1 时间间隔60d 连续超排结果

3.2 时间间隔90d 连续超排结果

由表2 可见，当供体母羊连续超排间隔90d 时，随着超排次数的增加，处理供体数量不变，且每次处理供体羊100%发情受孕。随着超排次数的增加，回收胚胎数量和可用胚胎数量呈逐渐下降趋势，组内各次，回收胚胎数量和可用胚胎数量相比较显著差异（P＜0.05)，受体羊两侧排卵点，随着超排次数的增加，呈逐渐下降趋势，经显著性分析，每一次超排后的排卵点与前一次相比较差异显著（P＜0.05)。平均每次每只供体羊能够出胚胎数6.7 个，平均每次每只供体羊排卵点为14.56 个。

表2 时间间隔90d 连续超排结果

3.3 时间间隔120d 连续超排结果

由表3 可见，当供体母羊连续超排间隔120d 时，随着超排次数的增加，处理供体数量不变，且每次处理供体羊100%发情受孕。数据用SPSS12.0 软件分析处理，进行显著性检验。随着超排次数的增加，回收胚胎数量和可用胚胎数量呈逐渐下降趋势，组内各次，回收胚胎数量和可用胚胎数量相比较显著差异（P＜0.05)，受体羊两侧排卵点，随着超排次数的增加，呈逐渐下降趋势，经显著相分析，每一次超排后的排卵点与前一次相比较差异显著（P＜0.05)。平均每次每只供体羊能够出胚胎数6.76 个，平均每次每只供体羊排卵点为14.15。

表3 时间间隔120d 连续超排结果

3.4 不同超排间隔对重复超排效果的影响

由表4 可知，与超排间隔60d 组相比，超排间隔60d 组和120d 组可回收胚胎数量、可用胚胎数量和排卵点数量均增加；且超排间隔60d 组回收胚胎数量、可用胚胎数量及排卵点数量明显少于间隔90d 组和间隔120d 组（P＜0.05)，间隔90d 组和间隔120d组之间则变化不显著（P＞0.05)。

表4 不同超排间隔对重复超排效果的影响

4 讨论

4.1 超排重复次数对超排的影响

一般认为对于同一供体，只要操作得当，重复超排数次之间留有一定的时间间隔，重复超排的效果并不随着超排次数的增加而降低[7,8]。但也有研究表明首次超排与重复超排的胚胎回收率和获卵数各有不同[9]。尹峰[10]对3 组不同周龄的东北细毛羊幼母羔的超排效果进行比较，结果首次超排的获卵数均明显多于重复超排。辛英霞等发现对同一批绒山羊分别间隔0d、300d、60d 连续进行3 次超数排卵，然后收集胚胎，结果显示前2 次的平均采胚数和平均有效胚胎数均较高，第三次则明显下降（P＜0.05)[11]。另有文献报道，肉羊做胚胎移植时，在FSH 保持不变的条件下，随超排次数增加，超排回收胚胎数量、排卵点呈现显著下降趋势[12]。本试验也是在保持肉羊超排中使用的FSH 剂量不变的条件下，其他饲养管理、手术条件一致的情况下，研究连续重复超排对超数排卵的影响。试验结果显示，各试验组组内，随着超排重复次数不断增加，回收胚胎数量和可用胚胎数量及排卵点均呈逐渐下降趋势（P＜0.05)。赵霞等[13]对20 头波尔山羊以45d 为间隔实施超排处理，结果显示前2 次超排所获得的平均可用胚胎数差异不显著，而第二次超排效果显著优于第三次超排，研究表明，这可能是由于随着超排次数的增加以及外源激素的连续使用，供体羊的卵巢对激素的反应可能会有减弱的趋势，进而引起发育的卵泡数和排卵数有所下降。一般来说，经过多次超排处理的母羊超排效果比较稳定，但并不是随着超排次数越多其超排的效果就越好，多数羊经过几次超排处理后，其超排效果会逐渐降低。一般认为，连续超排反应的降低和肉羊对激素产生的抗体有关，Valasi 等[14]研究表明，卵巢对激素的反应性降低是导致重复超排所获卵母细胞数量下降的主要原因。同时在重复超排过程中，多次超排处理也可能会对卵巢和子宫造成损伤，降低超排效果[15,16]。所以我们在实际胚胎移植生产中做连续超排时，并不能不考虑连续超排次数这一因素，进行连续超排时需要根据供体羊的胚胎移植次数和营养状况不断调整FSH 的使用剂量，同时要注意减轻手术对母羊的损伤，降低手术粘连和对卵巢的损伤程度，提高供体的超排利用效率，达到理想的超排效果。本试验因为手术和术后护理不当等原因，造成输卵管严重粘连而淘汰。

4.2 超排时间间隔对超排的影响

在发情周期的不同时期进行超排处理，超排效果不一样。且超排处理对母羊会产生较大的应激，超排间隔时间过短时，供体的生殖系统和内分泌的自我调节功能不能完全恢复，重复超排效果不稳定，超排间隔时间过长时，尽管能消除外源激素对卵巢刺激产生的影响，但会降低供体母羊的利用率[17]。适宜的超排时间间隔对超排效果以及后续胚胎移植效率有一定影响。对供体牛来说，一般同一供体个体超排间隔至少在60d 以上超排处理效果好。本试验是在保持肉羊超排中使用的FSH 剂量不变的条件下，其他饲养管理、手术条件一致的情况下，研究改变连续超排的时间间隔（间隔期分别为60、90、120d)对超数排卵的影响。试验数据显示，间隔60d 组供体羊平均每次可用胚胎数6.10 枚/只，平均每次排卵点为11.23 个/只；间隔90d 组供体羊平均每次可用胚胎数6.70 枚/只，平均每次排卵点为14.56 个/只；间隔120d 组供体羊平均每次可用胚胎数6.76 枚/只，平均每次排卵点为14.15 个/只。数据分析显示，试验间隔60d 组回收胚胎数量、可用胚胎数量及排卵点数量比间隔90d 组和间隔120d 组明显减少，间隔90d 组和间隔120d 组之间变化不显著。表明超排时间间隔较长利于超数排卵的数量与质量。这可能与试验的供体羊机体需要时间修复和机体对激素产生了抗体有关。但在实际生产过程中，超排时间间隔太长影响经济效益和性能改良速度。所以在肉羊胚胎产业化生产中，结合实际生产效益，要求超数排卵效果达到最佳的同时又要保证肉羊生产效益，这就需要研究确定适合本品种的超排间隔时间，或者通过让母羊超排后正常怀孕产羔一次，恢复供体母羊的生殖系统，以保证供体母羊的正常繁殖和优秀供体重复利用。本研究结果表明，杜泊母羊超数排卵最佳时间间隔为90d。

另外需要注意的是，采用手术法收集胚胎，除了考虑供体羊连续超排对激素产生抗体外，更重要的是要考虑连续手术对母羊生殖系统的损伤，这也是造成供体母羊超排胚胎数量下降的主要原因，严重者会发生粘连，失去正常的繁殖能力。手术中，操作要轻柔，尽量避免卵巢、输卵管、子宫体的牵拉损伤和出血，防止粘连，降低手术对超排的影响。

5 结论

肉羊进行连续超数排卵，随着超排次数的增加，回收胚胎数量和可用胚胎数量及排卵点个数呈逐渐下降趋势，需根据供体羊的胚胎移植次数和营养状况不断调整FSH 的使用剂量，保证超数排卵的效果；另超数排卵间隔较长有利于超数排卵的数量与质量，杜泊羊超排最少间隔90d 最佳。