黔中地区迷人杜鹃根系真菌多样性与群落结构分析*

王 陈，童 琪，2，周 艳，2，任少华，李 婧，2，胡 瑾，刘海燕▲

(1贵州省植物园，贵州 贵阳 550004；2国家林业和草原局西南喀斯特山地生物多样性保护重点实验室，贵州 贵阳 550004)

0 引言

迷人杜鹃(RhododendronagastumBalf.)属常绿灌木或小乔木，枝条粗壮，花大，呈粉红色，产于云南、贵州等地，生于海拔1600～1900 m的山坡常绿阔叶林或山地灌丛中，高度可达到6.5 m，是重要的园艺观赏花卉之一[1]。目前对迷人杜鹃的研究取得了一定的进展，主要集中在形态分类[2]、种子萌发特性[3]、抗旱性能力[4]、化感作用[5-7]、光适应性[8]等方面，然而对迷人杜鹃根际生态环境的研究尚未见报道，导致对根系微生物的了解，知之甚少[9]。

根际是植物根系活动对土壤影响最强烈、最直接的微域环境，其中土壤微生物在陆地生态系统的养分循环中发挥着重要的作用[10]。真菌是植物根际土壤中微生物的重要组成部分[11]，植物根系与土壤真菌形成的共生体被称为菌根，既能促进植物对土壤中营养元素的吸收及提高养分吸收的效率，还能保护植物免受土壤病原体入侵及增强抗逆性[12]。笔者以迷人杜鹃根内与根际土壤的真菌宏基因组为研究对象，运用高通量测序技术，分析了黔中地区迷人杜鹃根内生真菌与根际土壤真菌群落结构组成的相似处及差异性，并初步探讨了黔中地区迷人杜鹃根系真菌的多样性，为优化杜鹃的病害预防与生长管理提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 样品采集

采样区位于贵州省贵阳市云岩区贵州省植物园，地处东经106 °42′、北纬36 °24′，年均温15.2 ℃，年降水量为1200 mm，年平均相对湿度80%，海拔在1100～1200 m之间，园内杜鹃以马缨杜鹃与迷人杜鹃为主。在采集区内随机选择相邻3棵迷人杜鹃根系微生物，采集3个样品间隔距离约为50 m。

首先将迷人杜鹃根系上方杂草及周围土壤全部清开，然后用土壤刀沿着植株基部慢慢挖出细根，用无菌土壤刷采集根围的土壤(距离根围 0～5 mm)作为根际土，将其装入无菌采样袋中。再剪去部分根部样品放入另一个无菌采集袋中。4 ℃左右保存带回实验室，样品分别置于-80 ℃下冻存。其中根内生真菌为TMA，根际土壤真菌为TMB。

1.2 试验设计

1.2.1 根样中真菌基因组DNA提取

称取采集的根际土壤0.5 g，参照Power Soil DNA Isolation Kit试剂盒说明，提取样品宏基因组；将迷人杜鹃根系表层剥离去除，留下根内部分剪碎混合，运用差速离心法收集菌群，再按Power Soil DNA Isolation Kit试剂盒说明提取宏基因组。提取的DNA经Bio-Tek微孔板分光光度计检测完整性、浓度和质量，检测合格后可以进行真菌ITS区域扩增。

1.2.2 根系真菌ITS区域扩增测序

以提取的宏基因组为模板，扩增真菌ITS1区，将PCR产物送至生物技术公司(生工生物工程上海股份有限公司)，基于Illumina平台进行高通量测序。根据测序下机数据，进行质量控制分析，然后利用QIIME软件去除低质量及有嵌合体序列，获得有效序列，并合并。

1.3 数据分析

基于Ucluster算法，以序列相似度≥97%为阈值，将多条序列根据其序列之间的距离来对它们进行聚类，后根据序列之间的相似性作为阈值分成操作分类单元(OTU)，并根据各样本在OTU的分布情况绘制韦恩图。计算Shannon/Simpson/Coverage等物种多样性指数，并制作所有样品Shannon/Simpson/Richness指数的稀释性曲线。根据物种分类单元和样本丰度矩阵，利用统计检验筛选样本组间的差异物种分类单元，绘制误差线图。

2 结果与分析

2.1 迷人杜鹃根系样品的高通量测序数据

稀释性曲线采用对测序序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目来构建曲线[13]。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。结果表明(图1)，在使用97%相似度的OTU水平上，斜率起先快速增加而后渐渐减慢，最终逐渐趋于平坦，说明该测序数据量基本合理，能较准确地反映样品中真菌群落的丰富度与多样性。

香浓指数利用各样本的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，用以反映在不同测序数量时的微生物多样性[14]。曲线越平缓说明测序数量足够多，能有效反映样本中大多数微生物信息。由图2可知，在97%的相似度水平上，起初2个样品曲线直线上升，随着测序数量的增大，曲线直接进入平缓，表明测序接近饱和，可以反映出2个样品中绝大部分的真菌群落信息。

图1 根系真菌的稀释性曲线Fig.1 The dilution curve of root fungi

图2 根系真菌的Shannon-Wiener曲线Fig.2 The Shannon-Wiener curve of root fungi

2.2 迷人杜鹃根系真菌的群落结构

通过高通量测序方法对黔中地区迷人杜鹃根内与根外真菌群落组成进行结果分析，共获得有效序列116921条，按照97%的相似阈值对有效序列进行聚类，得出迷人杜鹃根系共有775个真菌OTUs，韦恩图(图3)显示，迷人杜鹃根内生真菌OTU总数367个，根际土壤真菌OTU总数652个，共有真菌OTU数244个，表明根内与根外真菌OTU值数量差异较大，根际土壤中单独富集的真菌菌群数量最多。

图3 共有分类单元(OTU)的Venn图Fig.3 Venn diagram of OTU

经聚类，根内生真菌367个OTU分属于8门、20纲、38目、71科、93属(图4)，优势菌群分属于8门真菌：Ascomycota(93.29%)、Basidiomycota(3.28%)、unclassified(2.49%)、Mortierellomycota(0.72%)、unclassified-Fungi(0.17%)、Chytridiomy cota(0.02%)、Rozellomycota(0.01%)、Mucoromycota(0.01%)。根际土壤真菌652个OTU分属于11门、25纲、50目、85科、114属(图5)，优势菌群分属于11门真菌：Ascomycota(84.60%)、Basidiomycota(9.32%)、unclassified(3.69%)、Mortierellomycota(1.71%)、unclassified-Fungi(0.29%)、Glomeromycota(0.19%)、Rozellomycota(0.09%)、Chytridiomycota(0.06%)、Mucoromycota(0.04%)、Cercozoa(0.01%)、Zoopagomycota(0.01%)。根系真菌中Ascomycota均占比最高，其中根内真菌丰度比例较根外真菌更高。

图4 迷人杜鹃根内生真菌群落结构Fig.4 The community structure of endophytic fungi in the root of Rhododendron agastum

根内生真菌8个菌门分类鉴定得到20纲，其中鉴别出丰度较高的8个纲分别为：Archaeorhizomycetes(61.96%)、Leotiomycetes(14.98%)、Eurotiomycetes(7.57%)、Sordariomycetes(5.57%)、Agaricomycetes(2.80%)、unclassified(2.49%)、unclassified-Ascomycota(1.68%)、Dothideomycetes(1.12%)。根际土壤真菌11个菌门分类鉴定得到25纲，其中丰度较高的8个纲分别为：Archaeorhizomycetes(75.52%)、Agaricomycetes(7.99%)、unclassified(3.69%)、Leotiomycetes(2.98%)、Sordariomycetes(2.41%)、Dothideomycetes(1.90%)、Mortierellomycetes(1.71%)、Tremellomycetes(1.08%)。根系真菌中Archaeorhizomycetes均占比最高，其中根外真菌丰度比例较根内真菌更高。

图5 迷人杜鹃根际土壤真菌群落结构Fig.5 The community structure of fungi in rhizosphere soil of Rhododendron agastum

根内生真菌38目中丰度较高的10个目依次为：Archaeorhizomycetales(61.96%)、Helotiales(14.47%)、Chaetothyriales(7.56%)、unclassified(2.49%)、unclassified-Sordar-iomycetes(1.74%)、unclassified-Ascomycota(1.68%)、Hypocreales(1.55%)、Sebacinales(1.32%)、Sordariales(1.21%)、Auriculariales(1.08%)。根际土壤真菌50目中丰度较高的10个目依次为：Archaeorhizomycetales(75.52%)、Sebacinales(5.98%)、unclassified(3.69%)、Helotiales(2.35%)、Mortierellales(1.71%)、Hypocreales(1.56%)、Pleosporales(1.53%)、Agaricales(1.52%)、unclassified-Ascomycota(0.95%)、Tremellales(0.63%)。根系真菌中Archaeorhizomycetales均占比最高，其中根外真菌丰度比例较根内真菌更高。

根内生真菌71科中丰度较高的10个科：Archaeorhizomycetaceae(61.96%)、Leotiaceae(7.10%)、unclassified-Helotiales(5.84%)、unclassified-Chaetothyriales(4.19%)、Herpotrichie-llaceae(3.36%)、unclassified(2.49%)、unclassified-Sordariomycetes(1.74%)、unclassified-Ascomycota(1.68%)、Hyaloscyphaceae(1.35%)、unclassified-Auriculariales(1.08)。根际土壤真菌85科中丰度较高的10个科：Archaeorhizomycetaceae(75.52%)、Serendipitaceae(3.83%)、unclassified(3.69%)、unclassified-Sebacinales(2.15%)、Mortierellaceae(1.68%)、Leotiaceae(1.23%)、Massarinaceae(1.14%)、unclassified-Helotiales(0.98%)、unclassified-Ascomycota(0.95%)、Clavariaceae(0.86%)。根系真菌中Archaeorhizomycetaceae均占比最高，其中根外真菌丰度比例较根内真菌更高。

根内生真菌93属中丰度较高的10个属：Archaeorhizomyces(61.96%)、Pezoloma(7.10%)、unclassified-Helotiales(5.84%)、unclassified-Chaetothyriales(4.19%)、Cladophialophora(3.12%)、unclassified(2.49%)、unclassified-Sordariomycetes(1.74%)、unclassified-Ascomycota(1.68%)、Hyaloscypha(1.35%)、unclassified-Auriculariales(1.08)。根际土壤真菌114属中丰度较高的10个属：Archaeorhizomyces(75.52%)、unclassified(3.69%)、unclassified-Serendipitaceae(3.43%)、unclassified-Sebacinales(2.15%)、Mortierella(1.68%)、Pezoloma(1.23%)、Massarina(1.14%)、unclassified-Helotiales(0.98%)、unclassified-Ascomycota(0.95%)、Clavaria(0.86%)。根系真菌中Archaeorhizomyces均占比最高，其中根外真菌丰度比例较根内真菌更高。

2.3 迷人杜鹃根系菌群差异性分析

由图6、图7可知，迷人杜鹃根系真菌菌门与菌属丰度比例存在显著差异(P<0.05)。9个门的真菌从根际进入根内时，8个丰度比例出现显著下降，1个丰度比例出现显著上升，且Ascomycota丰度比例差异最大。其中Basidiomycota、Mortierellomycota、unclassified、Glomeromycota、Rozellomycota、unclassified-Fungi、Chytridiomycota、Mucoromycota富集于根际，通过根表到根内后出现显著下降；Ascomycota富集于根内，通过根表到根内后出现显著上升。同时，25个属的真菌从根际进入根内时11个属丰度比例出现显著下降，14个属丰度比例出现显著上升，且Archaeorhizomyces丰度比例差异最大。其中Archaeorhizomyces、unclassified-Serendipitaceae、unclassified-Sebacinales、Massarina、Clavaria、Saitozyma、unclassified-Ceratobasidiaceae、Mortierella、Delicatula、unclassified-Hypocreales、unclassified富集于根际，通过根表到根内后出现显著下降；Pezoloma、unclassified-Helotiales、unclassified-Chaetothyriales、Cladophialophora、unclassified-Auriculariales、Hyaloscypha、unclassified-Sordariomycetes、unclassified-Sordariales、unclassified-Lecanorales、Cephalotheca、unclassified-Basidiomycota、Atractospora、Clonostachys、Serendipita富集于根内，通过根表到根内后出现显著上升。

图6 迷人杜鹃在门水平上根系真菌差异比较图(P<0.05)Fig.6 Comparison of root fungi in Rhododendron agastum at phylum level

图7 迷人杜鹃在属水平上根系真菌差异比较图(P<0.05)Fig.7 Comparison of root fungi in Rhododendron agastum at genus level

3 结论与讨论

根系真菌的多样性对于植物的多样性、生态系统的变异性和生产量起到了决定性的作用[15]。通过高通量测序分析取得迷人杜鹃根系真菌DNA序列116921条，聚类后得出迷人杜鹃根系共有775个真菌OTUs，其中根内生真菌367个OTU分属于8门、20纲、38目、71科、93属，根际土壤真菌652个OTU分属于11门、25纲、50目、85科、114属。根际土壤菌群OTU数量最大，说明受外界环境因子的影响，根际土壤真菌菌群多样性最为丰富。迷人杜鹃根系真菌优势菌群主要为Ascomycota(子囊菌门)和Basidiomycota(担子菌门)，其中子囊菌门有Archaeorhizomycetes(古生菌纲)、Leotiomycetes(锤舌菌纲)、Eurotiomycetes(散囊菌纲)、Sordariomycetes(粪壳菌纲)等；担子菌门有Agaricomycetes(伞菌纲)、Mortierellomycetes(被孢霉纲)等，与熊丹等[16]研究结果大致相同。Ascomycota(子囊菌门)和Basidiomycota(担子菌门)为迷人杜鹃根系真菌中的优势群类，研究表明在韭菜[17]、竹叶兰[18]、枸杞[19]等植物根系真菌中子囊菌门均为优势菌群，这与迷人杜鹃根系真菌群落能分离具有的菌根关系密切。

根系微生物的群落结构对于植物的健康起到了决定性的作用，植物抗逆性与根系微生物群落的集体基因组联系紧密[20]。在此生境场所中微生物易受到土壤营养物质含量、植物种类、氧气等多种外部环境因子的影响，且该区域的微生物种类丰富，会产生明显的根际效应[21]。通过根系分泌物，不同种类的植物会对微生物的群落结构以及土壤微生物多样性产生不同的影响[22]。本研究对迷人杜鹃根系真菌群落进行研究发现：迷人杜鹃根系分泌物对真菌群落的多样性存在着一定的抑制作用，根内与根外真菌OTU值数量差异较大。同时根际与根内不同的生态位决定了菌群结构的差异，在门水平上，丰度比例最高的Ascomycota(子囊菌门)通过根表到根内后出现显著上升，其余均出现显著下降。在属水平上，丰度比例最大的Archaeorhizomyces通过根表到根内后出现显著下降，其余从根表进入根内时10个属出现显著下降，14个属丰度比例出现显著上升，说明生态位对真菌群落差异的影响是显著性的[23]，生态位的差异促进了菌群数量和结构的多样化。然而迷人杜鹃根系分泌物的成分、种源的差异以及生长地的不同气候因子都会对杜鹃根系微生物的多样性及其群落结构产生影响[24]，深入分析杜鹃根系微生物群落与外部因子的相关性也是今后研究工作的方向之一。

黔中地区迷人杜鹃根系土壤真菌多样性较丰富，根内生真菌与根际土壤真菌OTU值数量差异较大，且根际土壤真菌菌群多样性更为丰富。Ascomycota(子囊菌门)和Basidiomycota(担子菌门)为根系真菌中的优势群类，与其他植物根系真菌优势菌群一致。同时受不同生态位的影响，根内与根外真菌群落间存在显著性差异。