基于生物信息学筛选膀胱癌预后相关的关键miRNAs 并验证

邹震海，程 琪，李 中，刘贝贝，高五岳，孙 巍，郭园园，刘建民

（蚌埠医学院第一附属医院泌尿外科，安徽 蚌埠 233004）

膀胱癌（bladder cancer）是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。吸烟、遗传因素以及接触芳香胺和其它工业化学品被认为是膀胱癌发生发展的原因[1]。在所有新诊断的病例中，75%表现为非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC），25%表现为肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）[2]。对于MIBC 患者，转移的发生更加频繁，预后更差，大约有50%的可能发展为转移性疾病，其平均生存时间为14～15 个月[3]，且没有针对这些患者的治愈性治疗选择。因此，进一步研究驱动膀胱癌进展的分子机制和确定潜在的治疗靶点具有重要意义。微小核糖核酸（miRNAs）是一种小的非编码核糖核酸，长度在21～25 个核苷酸不等[4]。目前发现miRNAs 参与了哺乳动物基因组中超过50%的mRNA 的调控[5]。miRNAs 主要通过与特定目标mRNA 的3'-非翻译区（3'-UTR）的碱基配对来调控基因转录，从而导致基因表达量的改变[6]。单个miRNA 能够沉默多个基因的表达，反过来，一个基因可以被多个miRNA 调控[7]。目前，多种miRNAs 已经被证实能够对膀胱癌细胞的生物学功能产生影响，包括细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡[8，9]。新一代测序（NGS）技术的快速发展和癌症基因组图谱（TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov/）数据库的建立，产生了许多大规模的癌症基因组数据集，为利用生物信息学分析来预测相关的肿瘤生物标志物提供了基础。本研究通过从TCGA 数据库中获取膀胱癌患者的miRNAs 数据及相应的预后信息，筛选出有重要预后价值的关键miRNAs 行下游靶基因的预测以及GO 和KEGG 通路分析，并通过实验进行验证，以期为膀胱癌的靶向治疗提供新思路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 生物信息学资料来源 从TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）中共下载418 例膀胱癌（BLCA）及19 例正常对照的miRNA 数据及相应的临床病理特征及生存信息。临床病理特征包括：年龄、性别、分级、分期以及T 分期。

1.1.2 材料及试剂 正常人尿路上皮细胞系SVHUC-1 以及膀胱癌细胞系T24 来源于中国科学院上海细胞库；RPMI-1640 培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗和胰酶购自美国Gibco 公司；脂质体转染试剂Lipo2000、TRIzol、PowerUp SYBR Green Master MIX PCR 试剂盒购自美国Thermo Fish 公司；miR-NC、miR-944 mimics 和miR-1307-5p mimics 均由上海吉玛公司设计并合成。miR-944 mimics序列:正义5'-AAAUUAUUGUACAUCGGAUGAG-3'、反义5'-CAUCCHAUGUACAAUAAUUUUU-3' ；MiR-1307-5p inhibitor 序列：正义5'-UCGACCGGACCUCGACCGGCU-3'、反义5'-CCGGUCGAGGUCCGGUCGAUU-3'。

1.2 方法

1.2.1 差异miRNAs 的获取 利用R 软件（v3.5.2）中edgeR 包计算差异表达的miRNAs，筛选条件：log－FoldChange=1，Padj=0.05。利用Plot 函数及Pheatmap包分别绘制火山图及热图。

1.2.2 与总生存期相关的miRNAs 获取 从TCGA 数据库中下载BLCA 患者的临床生存等病理信息，基于上述差异表达的miRNAs 列表，利用survival 包进行Kaplan-Meier 单因素生存分析的方法绘制不同miRNAs 高低表达的生存曲线。

1.2.3 miRNAs 与临床病理信息之间的相关性分析将优选miRNAs 与患者5 个临床性状进行相关性分析（年龄、性别、分级、分期以及T 分期），利用t或Kruskal 检验，将miRNAs 表达量按临床性状分别分为两组，得到相关性分析结果的列表。

1.2.4 预测miRNAs 靶基因及GO 和KEGG 分析 利用3 大常用的miRNA 预测靶基因的数据库（miRDB、miRWalk、TargetScan）预测相应的靶基因，两个及以上的数据库都预测到的靶基因作为下一步GO 和KEGG 通路分析的基因，并绘制相应的韦恩图。通过DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对预测的靶基因进行GO 和KEGG 通路分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义；其中GO 分析包括生物过程、细胞组成和分子功能。

1.2.5 细胞培养及转染 正常人尿路上皮细胞系SVHUC-1，以及膀胱癌细胞系T24 细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中培养。培养箱条件37 ℃、5% CO2。当细胞处于对数生长期时，0.25%胰酶消化传代，每2 d 换液或传代1 次。在其生长状态良好时，将T24 细胞接种于6 孔板中，生长至60%融合度，按照Lipofectamine 2000 试剂说明书，将miR-NC、miR-944 mimics 和miR-1307-5p mimics转染入细胞。

1.2.6 CCK8 细胞增殖实验 将转染后的T24 细胞接种于96 孔板中，分别培养24、48、72 h 后，每孔加入10 μl CCK8 溶液，避光，37 ℃条件下孵育1 h，酶标仪检测细胞在450 nm 处的吸光度值（OD450 nm 值）。

1.2.7 Transwell 小室法 细胞侵袭实验中，上室制备Matrigel 胶后，将细胞加入无血清培养基中，吸取100 μl 加入上室。下室加入含20%胎牛血清的RPMI-1640 培养基。37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，轻轻去除上室中的细胞和Matrigel 胶，用4%多聚甲醛固定30 min 后结晶紫染色，显微镜下拍照并分析。细胞迁移实验中，Transwell 上室不加入Matrigel 胶，其余步骤同细胞侵袭实验。

1.2.8 流式细胞术 收集转染后的细胞，取5～10 万重悬的细胞，1000 g 离心5 min，弃上清。加入PBS 重悬后，1000 g 离心5 min，以195 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞。加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl碘化丙啶染色液，混匀后室温孵育10～20 min，流式上机检测。

1.2.9 总RNA 提取及qRT-PCR 根据说明书，使用Trizol 试剂从细胞中分离总RNA，将RNA 逆转录成互补脱氧核糖核酸（cDNA），PowerUp SYBR Green Master MIX PCR 试剂盒用于测定miRNA（U6 作为内参基因）的表达水平。2ΔΔCt 法用于计算目的基因的相对表达量。使用Primer 5.0 设计引物，见表1。

表1 引物序列

1.3 统计学方法 基因表达数据通过log2转换标准化，使用R 软件3.6.2 和Perl 语言包构建图，另使用SPSS 22.0 统计学软件和GraphPad Prism9 进行实验数据分析处理，计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌差异miRNAs 的筛选结果 通过对从TCGA 数据库中共下载的418 例膀胱癌及19 例正常对照的miRNA 数据进行分析，共筛选出293 个差异表达的miRNAs，其中高表达224 个，低表达69个，绘制火山图见图1。

图1 差异表达miRNAs 的火山图

2.2 差异表达的miRNAs Kaplan-Meier 单因素生存分析 基于上述293 个差异表达的miRNAs，利用survival 包进行Kaplan-Meier 单因素生存分析的方法绘制不同miRNAs 高低表达的生存曲线，共得到65 个OS 生存曲线中P值＜0.05 的miRNAs，根据P值大小，选择表现出重要预后价值的前9 个miRNA（图2）。Kaplan-Meier 生存曲线分析显示，miR-502b-3p、miR-1307-5p、miR-1910-5p、miR-944 的高表达和miR-483-5p、miR-483-3p、miR-615-3p、miR-217-5p、miR-708-3p 的低表达将有利于膀胱癌的预后。

图2 9 种miRNAs 的OS 生存曲线图

图2 9 种miRNAs 的OS 生存曲线图（续）

2.3 miRNAs 与临床病理信息之间的相关性分析 将优选的9 个miRNAs 与患者5 个临床性状进行相关性分析（年龄、性别、分级、分期以及T 分期），利用Kruskal 检验，将9 个miRNAs 表达量按临床性状分别分为两组，并得到相关性分析结果的列表（表2）。根据P值，共有2 种miRNA 与膀胱癌的临床病理信息相关，分别是miR-1307-5p 和miR-944，其中miR-1307-5p 与患者年龄、分级、分期以及T 分期相关，miR-944 与患者分级、分期以及T 分期相关（P＜0.05）。

表2 膀胱癌中优选的9 个miRNAs 的相关性分析结果

2.4 差异表达的关键miRNAs 靶基因的预测分析利用3 大常用miRNA 预测靶基因的数据库（miRDB、miRWalk、TargetScan）预测相应的靶基因，两个及以上的数据库都预测到的靶基因作为下一步GO 和KEGG 通路分析的基因，去除9 个重复的基因，总共留下1669 个靶基因用于进一步的GO 和KEGG 通路分析，并绘制相应的韦恩图，见图3。

图3 3 大miRNA 靶基因数据库预测的靶基因

2.5 预测靶基因的GO 和KEGG 通路分析 通过DAVID 数据库对预测的靶基因进行GO 和KEGG通路分析，GO 分析显示，预测的靶基因在生物过程中主要富集于神经系统发育、多细胞生物发育、解剖结构发育、单细胞-多细胞生物过程和发育进程，细胞组成中主要富集于细胞内、细胞内成分、细胞器、细胞内细胞器和细胞质，分子功能中主要富集于离子结合、阳离子结合、金属离子结合、转移酶活性和蛋白质丝氨酸，见表3；KEGG 通路分析显示，预测的靶基因主要富集于长寿通路、mTOR 信号通路和EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性等通路中，见表4、图4。

图4 miRNA 靶基因的KEGG 信号通路分析

表3 排名前5 位的miRNA 靶基因的GO 功能富集分析

表4 排名前10 位的miRNA 靶基因的KEGG 信号通路富集分析

2.6 miR-944 和miR-1307-5p 在膀胱癌细胞中的表达水平 与正常尿路上皮细胞SV-HUC-1 相比，膀胱癌T24 细胞中miR-944 的表达水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05），而miR-1307-5p 的表达水平无变化（P＞0.05），见图5。

图5 miR-944 和miR-1307-5p 在膀胱癌细胞中的表达水平

2.7 过表达miRNA 对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响 CCK8 增殖实验显示，与mimics-NC 组相比，miR-944 mimics 组的T24 细胞的增殖能力减弱,差异有统计学意义（P＜0.05），见图6A；Transwell迁移和侵袭实验显示，miR-944 mimics 组的T24 细胞的迁移和侵袭能力均减弱，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6B；流式细胞术分析显示，miR-944 mimics 组的T24 细胞凋亡增加，差异有统计学意义（P＜0.05），但过表达miR-1307-5p 后膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡无明显变化，见图6C。

图6 miR-1307-5p 和miR-944 对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响

图6 miR-1307-5p 和miR-944 对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响（续）

3 讨论

膀胱癌是全球第9 大常见的恶性肿瘤，每年大约有356 000 例新增病例和145 000 例死亡病例，具有复发倾向，需要在诊断后终生监测[10，11]。miRNAs是一类短的非编码RNA，能够与目标mRNA 上的互补序列结合，通过抑制蛋白质的翻译或增加mRNA的降解来诱导基因沉默[12]。目前miRNAs 的异常表达已被证明与多种人类疾病有关[13]。Yin Z 等[14]研究发现，miR-96-5p 能够负性调控抑癌基因FOXO3，促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭，从而发挥促癌作用。Chen Y 等[15]研究证明，miR-148a 通过靶向Wnt1 抑制肺癌细胞的迁移和侵袭，这可能为肺癌转移的分子机制提供新的思路。然而，还有许多miRNA 在膀胱癌中发挥着抑癌或促癌的作用，其功能和机制仍需进一步研究。因此，本研究对TCGA 数据库中下载的418 例膀胱癌患者及19 例正常对照的miRNAs数据进行生物信息学分析，利用R 软件中edgeR 包获取差异表达的miRNAs，共筛选出293 个差异表达的miRNAs，其中高表达224 个，低表达69 个。再利用survival 包进行Kaplan-Meier 单因素生存分析，选择表现出重要预后价值的前9 个miRNAs，最后通过临床病理信息的相关性分析得到2 个密切相关的miRNAs，分别是miR-1307-5p 和miR-944。

研究表明[16]，miR-1307-5p 和miR-944 与肿瘤的发生发展均密切相关。miR-1307-5p 是通过修饰miR-1307 前体的5' 端粒获得的一种成熟体miRNA，其可通过靶向ING5 的表达来提高卵巢癌细胞的化疗耐药性。Du X 等[17]通过一系列体内外实验表明，miR-1307-5p 也能够促进肺腺癌增殖，该作用机制是通过靶向TRAF3 上调MAPK/NF-κB 通路实现的。miR-944 最早通过miRNAs 克隆法在人宫颈细胞中鉴定获得[18]，该miRNA 位于肿瘤蛋白p63（TP63）基因的内含子中，定位于人3q28 染色体上[19]。miR-944 的异常表达在人类恶性肿瘤中发挥抑癌或致癌的作用。研究表明[20]，miR-944 在结直肠癌患者中的表达水平显著降低，并且通过靶向下游调节因子MACC1 抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭，这表明miR-944 可能在结直肠癌中发挥抗转移作用。但miR-944 在宫颈癌中又显著过表达，并通过靶向HECT 结构域连接酶W2（HECW2）和S100P 结合蛋白（S100PBP）促进细胞增殖、迁移和侵袭[21]。然而，在膀胱癌中，这两种miRNAs 的具体作用有待进一步的验证。

为了更深入地了解这2 种miRNAs 的分子机制，3 大常用miRNA 预测靶基因的数据库（miRDB、miRWalk、TargetScan）被用于预测相应的靶基因并利用DAVID 数据库对预测的靶基因进行了GO 富集和KEGG 通路分析。GO 分析显示，预测的靶基因在生物过程中主要富集于神经系统发育、多细胞生物发育、解剖结构发育、单细胞-多细胞生物过程和发育进程，细胞组成中主要富集于细胞内、细胞内成分、细胞器、细胞内细胞器和细胞质，分子功能中主要富集于离子结合、阳离子结合、金属离子结合、转移酶活性和蛋白质丝氨酸；KEGG 通路分析显示，预测的靶基因主要富集于长寿通路、mTOR 信号通路和EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性等通路中。以上结果说明这两种miRNA 可能通过影响膀胱癌细胞内的细胞质和细胞器的功能以及干扰金属阳离子等其他物质的结合发挥相应的作用。最后，相关分子生物学技术和细胞实验进一步验证了生物信息学分析的结果，qRT-PCR 分析显示miR-944 在膀胱癌细胞中的表达水平下调，而miR-1307-5p 的表达水平无明显差异。同时，细胞功能学实验也证实了miR-944 对膀胱癌细胞生物行为的抑制作用，这与上述qRT-PCR 的结果一致。

总之，本研究利用来自TCGA 数据库中膀胱癌患者的miRNAs 数据和预后信息，分析了膀胱癌组织和正常膀胱上皮组织之间的miRNAs 表达以及各项临床病理数据，获得了2 种异常表达的miRNAs。通过进一步的分析，预测了miRNAs 的下游靶基因和靶基因富集的信号通路，最后进行相关实验验证后发现miR-944 有潜力成为预测膀胱癌诊断、治疗和预后的一种新的生物标志物。