白术乙醇提取物调节PPAR-γ信号通路促进小胶质细胞摄取及降解Aβ的作用机制研究 Δ

初双 ，吴延娆 ，吴丽敏 ，崔正浩 ，王潘 ，孙意冉 ，谢治深 ，张振强 （.河南中医药大学中医药科学院，郑州 450046；.河南中医药大学第一附属医院药学部，郑州 45005）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是以进行性认知功能障碍为主要特征的神经退行性疾病，脑内β淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积是AD的主要病理学特征[1—2]。有研究表明，小胶质细胞具有吞噬与降解Aβ的功能，可以通过降解Aβ沉积形成的斑块，发挥保护神经的作用，从而改善AD[3]。然而，当小胶质细胞出现功能障碍时，则可增加Aβ沉积，加重AD[4]。因此，促进小胶质细胞摄取和降解异常累积的Aβ是改善AD的有效策略之一[5]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）属于核激素受体超家族，可与PPAR反应元件（PPAR response elements，PPREs）结合，形成一种有效的转录因子[6]。PPAR-γ激活后会促进下游基因Abcg1、Sra、Cd36、Lxr、Apoe及Abca1的表达，从而增强小胶质细胞对Aβ的摄取及降解[7]。

中医将AD归属于“痴呆”范畴，认为痴呆病位在脑，多为本虚标实之证，以脏腑精气亏虚、脑失所养为本，痰气交阻为标。脾主运化，脾失健运则气血亏虚，脑髓失养而生痴呆；脾喜燥恶湿，脾气亏虚则运化水液失常，水湿停聚内生痰湿，痰蒙清窍亦生痴呆。脾虚痰湿是早期AD发生发展的病机之一，故健脾化痰为治疗AD的有效方法之一[8]。中药白术为菊科苍术属植物白术Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根茎，被誉为“脾脏补气健脾”第一要药。本课题组前期研究发现，白术乙醇提取物（ethanol extract fromAtractylodes macrocephala，EEAM）可延缓AD模型秀丽隐杆线虫CL4176的瘫痪时间，调节溶酶体自噬，降解淀粉样蛋白前体蛋白，从而改善AD[9—11]。但是白术乙醇提取物是否可通过PPAR-γ信号通路促进小胶质细胞对Aβ的摄取及降解，尚不明确。基于此，本研究以小鼠小胶质细胞BV2为研究对象，从PPAR-γ信号通路出发，探讨EEAM促进小胶质细胞对Aβ摄取及降解的作用机制，以期为EEAM治疗AD的临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有Airtech型超净台（苏州安泰空气技术有限公司），Forma Series Ⅱ Water Jacket型二氧化碳细胞培养箱、Multiskan GO型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），Axiocam 506 Color型显微镜、LSM700型共聚焦荧光显微镜（德国Carl Zeiss公司），FLUOstar OPTIMA型多功能酶标仪（德国BMG Labtech公司），Roche LightCycler 96型实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（美国ABI公司）。

1.2 主要药品与试剂

白术饮片购自安徽亳州药材市场，经河南中医药大学药学院付钰副教授鉴定为菊科植物白术A.macrocephalaKoidz.的干燥根茎。pCMX-Gal-mPPAR-γ及PPRE-J3-TK-Luc质粒由本实验室构建。兔源PPAR-γ多克隆抗体（批号00105869）购自武汉三鹰生物技术有限公司；山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批号GR3401492-2）购自美国Abcam公司；Aβ1-42、FEEAM-Aβ（批号分别为CPC221027110、T2P1000485）均购自苏州强耀生物科技有限公司；Hoechst 33342、MEM基础培养基、DMEM基础培养基、TriQuick Reagent总RNA提取试剂（批号分别为20190412、20200716、10013031、229009）均购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清（批号12A089）购自上海依科赛生物制品有限公司；PolyJet转染试剂（批号61758）购自深圳恩科生物科技有限公司；逆转录试剂盒（批号103118190503）购自上海碧云天生物技术有限公司；罗格列酮（批号C10534101，纯度98%）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；萤光素酶报告基因检测试剂盒（批号0000312919）购自美国Promega公司。

1.3 细胞

小鼠神经小胶质细胞BV2购自武汉普诺赛生命科技有限公司；人胚胎肾细胞HEK293购自中国科学院细胞库。

2 方法

2.1 EEAM的制备

参考本课题组前期制备方法[12]操作：称取白术饮片2 kg，共加入95%乙醇4 L分别浸渍3次，每次1周；合并滤液，减压浓缩得到EEAM浸膏359 g，得率为17.95%（以生药量计），置于4 ℃下保存，备用。

2.2 细胞培养

将BV2细胞以含有10%胎牛血清、1%青-链霉素混合液的MEM完全培养基培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞密度达到80%左右时，进行后续实验。将HEK293细胞以含有10%胎牛血清、1%青-链霉素混合液的DMEM完全培养基培养，然后同上述条件培养后进行后续实验。

2.3 EEAM对BV2细胞活力的影响

采用MTT法对细胞活力进行测定。取对数生长期的BV2细胞接种于96孔板中，培养24 h后，将细胞分为空白对照组和EEAM低、中、高剂量组（0.3、0.4、0.5 mg/mL，剂量参考前期预实验设置），每组设置6个复孔。各孔加入相应含药培养基培养24 h后，避光加入5 mg/mL MTT溶液20 µL，继续培养4 h；弃去培养基，每孔加入二甲基亚砜150 μL，摇床振摇10 min，采用酶标仪在490 nm处测定各孔光密度（optical density，OD）值，并计算细胞存活率（细胞存活率＝给药组OD值/空白对照组OD值×100%）。

2.4 EEAM对BV2细胞摄取及降解Aβ的影响

采用共聚焦皿平行铺BV2细胞，分为摄取组及降解组，2组细胞再分别设置空白对照组、阳性对照组（1 μmo/L罗格列酮，剂量参考文献[13]及预实验结果设置，下同）和EEAM低、中、高剂量组（0.3、0.4、0.5 mg/mL），每组设置3个复孔。培养过夜后，次日分别给予相应药物处理24 h，每皿加入500 nmol/L FAM-Aβ（带有红色荧光标记的Aβ）避光染色4 h；染色结束后，摄取组细胞用Hoechst 33342对细胞核进行染色，经磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后在激光共聚焦荧光显微镜下拍照，观察BV2细胞对Aβ的摄取作用。降解组细胞以500 nmol/L FAM-Aβ避光染色4 h后，更换为MEM完全培养基继续培养6 h，用Hoechst 33342和溶酶体绿色荧光探针分别对细胞核及溶酶体进行染色，经PBS清洗后在激光共聚焦荧光显微镜下观察BV2细胞对Aβ的降解作用。

2.5 EEAM对HEK293细胞中PPAR-γ萤光素酶转录活性的影响

萤光素酶报告基因是转录活性测定的常用工具之一，萤光素酶催化底物产生化学发光，萤光素酶表达量越高，化学发光度越强，从而表明目的基因转录活性越强[14]。HEK293细胞是人胚胎肾细胞的细胞系，该细胞具有高度的可转染性，常用作报告基因检测的工具细胞[15]。基于此，笔者参考相关文献[16]，采用HEK293细胞探讨EEAM对PPAR-γ转录活性的影响。取对数生长的HEK293细胞接种于96孔板中，待细胞密度达到80%左右时，用PolyJet转染试剂进行转染；每孔转染pCMXGal-mPPAR-γ、PPRE-J3-TK-Luc质粒各100 ng，并于转染6 h后更换为DMEM完全培养基。次日，将转染后的细胞分为空白对照组、阳性对照组（1 μmol/L罗格列酮）和EEAM低、中、高剂量组（0.3、0.4、0.5 mg/mL），每组设置6个复孔。分别给予相应药物培养24 h后，采用多功能酶标仪检测各孔萤光素酶活性。此外，取对数生长的HEK293细胞按上述方法接种、转染后，给予高剂量（0.5 mg/mL）EEAM处理后，分别培养6、12、18、24 h时，同上述方法检测萤光素酶活性。

2.6 EEAM对BV2细胞中PPAR-γ核移位的影响

采用免疫荧光法进行实验。将BV2细胞接种于提前加入细胞爬片的24孔板中，按照“2.4”项下方法分组、培养，每组设3个复孔。24 h后加入4%多聚甲醛固定细胞1～2 h，经PBS清洗后，用0.3% Triton-X室温孵育30 min，以山羊血清封闭2 h，经PBS清洗后，于4 ℃条件下以PPAR-γ一抗（稀释度为1∶200）孵育过夜，次日加入二抗（稀释比例为1∶300）室温避光孵育2 h；加入Hoechst 33342染色30 min，经PBS清洗后，取出爬片，采用显微镜观察荧光情况，并用Image J软件分析各组细胞中PPAR-γ蛋白的荧光强度及核移位情况。细胞中PPAR-γ蛋白荧光强度增强，则表明PPAR-γ表达水平升高；另外，当在细胞核中检测到PPAR-γ，也表明其被激活[17]。

2.7 EEAM对BV2细胞中PPAR-γ下游靶基因表达的影响

采用qPCR进行实验。取对数生长期的BV2细胞接种于6孔板中，培养24 h后，将细胞分为空白对照组、AD模型组和EEAM低、中、高剂量组（0.3、0.4、0.5 mg/mL），每组设置3个复孔。加入相应药物（空白对照组和模型组加入培养基），除空白对照组外，其余组也加入Aβ1-42（终浓度为5 μmol/L）。培养24 h后，用Trizol法提取细胞总RNA，测定其纯度及浓度后，按照逆转录试剂盒方法进行逆转录得到cDNA。以cDNA为模板进行PCR，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的表达水平。PCR引物序列及扩增产物长度见表1。

表1 PCR引物序列及扩增产物长度

2.8 统计学方法

所有数据采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析，计量资料均以±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Student'st检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 EEAM对BV2细胞活力的影响结果

EEAM低、中、高剂量组细胞存活率[分别为（103.76±7.58）%、（111.27±6.05）%、（109.54±7.32）%]与空白对照组[（100.00±10.03）%]比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3.2 EEAM对BV2细胞摄取和降解Aβ的影响结果

Aβ摄取实验结果显示，与空白对照组比较，阳性对照组和EEAM中、高剂量组BV2细胞中Aβ荧光强度均显著升高（P＜0.05）。Aβ降解实验结果显示，与空白对照组比较，阳性对照组和EEAM中、高剂量组BV2细胞中Aβ荧光强度均显著降低（P＜0.05），阳性对照组及EEAM高剂量组BV2细胞中溶酶体荧光强度显著升高（P＜0.05）。结果见图1、图2、表2。

表2 各组BV2细胞中Aβ摄取和降解荧光强度以及溶酶体荧光强度的检测结果（±s，n＝3）

表2 各组BV2细胞中Aβ摄取和降解荧光强度以及溶酶体荧光强度的检测结果（±s，n＝3）

a：与空白对照组比较，P＜0.05

组别空白对照组阳性对照组EEAM低剂量组EEAM中剂量组EEAM高剂量组溶酶体荧光强度1.00±0.17 2.10±0.18a 1.08±0.15 1.35±0.18 2.23±0.11a Aβ摄取荧光强度1.00±0.03 1.46±0.27a 1.00±0.02 1.07±0.01a 1.65±0.06a Aβ降解荧光强度1.00±0.06 0.68±0.17a 1.04±0.05 0.96±0.04a 0.72±0.06a

图1 各组BV2细胞摄取Aβ的荧光显微图

图2 各组BV2细胞降解Aβ的荧光显微图

3.3 EEAM对HEK293细胞中PPAR-γ萤光素酶转录活性的影响

与空白对照组（1.00±0.11）比较，阳性对照组（1.73±0.15）和EEAM各剂量组（分别为1.65±0.21、1.65±0.14、1.77±0.19）HEK293细胞中PPAR-γ萤光素酶转录活性显著升高（P＜0.05）。另外，以高剂量EEAM培养6、12、18、24 h后，HEK293细胞中PPAR-γ萤光素酶转录活性（分别为1.31±0.22、1.44±0.86、1.51±0.16、1.95±0.28）均显著升高（P＜0.05），且处理24 h后的转录活性最强。

3.4 EEAM对BV2细胞中PPAR-γ核移位的影响结果

与空白对照组比较，阳性对照组和EEAM各剂量组BV2细胞中和细胞核中PPAR-γ蛋白的荧光强度（低剂量组除外）均显著升高（P＜0.05），结果见表3、图3。

图3 各组BV2细胞中PPAR-γ核移位的荧光显微图

表3 各组BV2细胞中和细胞核中PPAR-γ蛋白荧光强度的测定结果（±s，n＝3）

表3 各组BV2细胞中和细胞核中PPAR-γ蛋白荧光强度的测定结果（±s，n＝3）

a：与空白对照组比较，P＜0.05

组别空白对照组阳性对照组EEAM低剂量组EEAM中剂量组EEAM高剂量组细胞核中PPAR-γ 1.00±0.05 1.30±0.06a 1.08±0.06 1.21±0.09a 1.41±0.14a细胞中PPAR-γ 1.00±0.04 1.42±0.05a 1.22±0.12a 1.38±0.01a 1.41±0.05a

3.5 EEAM对PPAR-γ下游靶基因mRNA表达的影响结果

与空白对照组比较，AD模型组BV2细胞中LxramRNA的表达水平显著降低（P＜0.05），其余基因mRNA的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与AD模型组比较，各给药组BV2细胞中Lxra、Lxrb、Abca1、Abcg1、Cd36、Sra、ApoemRNA的表达水平均显著升高（P＜0.05）。结果见表4。

表4 各组BV2细胞中PPAR-γ下游靶基因mRNA的测定结果（±s，n＝3）

表4 各组BV2细胞中PPAR-γ下游靶基因mRNA的测定结果（±s，n＝3）

a：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05

组别空白对照组AD模型组阳性对照组EEAM低剂量组EEAM中剂量组EEAM高剂量组Apoe mRNA 1.00±0.10 0.75±0.03 1.43±0.07b 2.23±0.22b 1.87±0.02b 2.08±0.04b Lxra mRNA 1.00±0.06 0.59±0.04a 1.45±0.10b 1.28±0.14b 1.27±0.07b 1.55±0.23b Lxrb mRNA 1.00±0.13 1.14±0.07 1.77±0.95b 2.71±0.30b 3.52±0.41b 7.44±0.34b Abca1 mRNA 1.00±0.66 1.25±0.76 6.10±0.33b 3.54±0.30b 14.60±0.73b 26.10±0.18b Abcg1 mRNA 1.00±0.22 0.99±0.10 1.28±0.06b 3.91±0.12b 3.79±0.76b 13.20±0.84b Cd36 mRNA 1.00±0.06 0.77±0.01 1.20±0.44b 3.90±0.08b 4.27±0.49b 7.71±0.53b Sra mRNA 1.00±0.09 0.98±0.04 1.70±0.08b 1.79±0.11b 2.09±0.11b 3.01±0.11b

4 讨论

随着全球社会老龄化的加剧，AD发病率也逐年升高。在AD病理中，Aβ的生成与清除失衡是造成脑内斑块沉积的主要原因之一。白术为补气健脾第一要药，具有神经保护等多种药理作用[18]，本课题组前期研究发现，其对AD具有改善作用[11]，但具体作用机制不明。Aβ沉积是AD的主要病理学特征[1]。有研究表明，小胶质细胞具有摄取与降解Aβ的功能[3]。基于此，本研究以BV2细胞为研究对象，探讨EEAM对Aβ摄取及降解的作用机制。Aβ摄取实验结果显示，经EEAM干预后，BV2细胞中Aβ荧光强度升高。Aβ降解实验结果显示，经EEAM干预后，BV2细胞中Aβ荧光强度降低，且溶酶体荧光强度升高。这提示EEAM可通过促进BV2细胞对Aβ的吞噬和降解作用改善AD，且在促进Aβ降解的同时也增强了溶酶体活性。

PPAR-γ是依赖配体激活的转录因子，在Aβ稳态、炎症和能量代谢的各种基因调节中发挥重要作用[17]。PPAR-γ激动剂可以减轻或逆转AD动物模型中Aβ负荷、炎症及疾病相关行为障碍[19]。报告基因是识别及表征功能的有力工具，在研究基因表达及转录因子等方面具有重要作用[14]，故本研究采用萤光素酶报告基因系统探究EEAM对PPAR-γ通路的作用。本研究结果显示，经EEAM干预后，HEK293细胞中PPAR-γ萤光素酶转录活性升高。这提示，EEAM可提高PPAR-γ转录活性。PPAR-γ作为转录因子，只有进入细胞核才能发挥作用，因此核移位也是PPAR-γ激活的标志[17]。进一步研究结果显示，经EEAM干预后，BV2细胞核中PPAR-γ的荧光强度也有所升高。这提示EEAM可通过促进PPAR-γ的核移位改善AD。

Abcg1、Cd36、Sra、Lxr、Apoe及Abca1均为PPAR-γ的下游靶基因，Abcg1基因编码的蛋白质是atp结合盒（ABC）转运蛋白家族成员，可通过消除大脑中的有毒肽维持正常的脑内稳态[20]；Cd36是B类清零受体，在脑中小胶质细胞进行表达，可介导小胶质细胞对Aβ的吞噬作用[21]；Sra是一种多功能受体，具有吞噬作用，研究表明在Sra基因敲除小鼠中，Aβ含量与正常小鼠相比有明显升高[22]。这说明Cd36、Sra基因对Aβ的摄取作用具有重要意义。Lxr基因属于核受体超家族，包括Lxra和Lxrb两种亚型，其可激活Apoe和Abca1，进而促进小胶质细胞对 Aβ 的清除作用[23—25]。这说明Lxra、Lxrb、Apoe、Abca1基因对Aβ的降解作用具有重要意义。本研究结果表明，经EEAM处理后，BV2细胞中Abcg1、Cd36、Sra、Lxr、Apoe、Abca1mRNA的表达水平均升高。这表明EEAM可通过上调PPAR-γ下游靶基因改善AD。

综上所述，EEAM可通过激活PPAR-γ信号通路，促进小胶质细胞对Aβ的摄取与降解作用，进而改善AD。由于体内与体外环境存在差异，后续本课题组将进一步开展动物体内实验对上述结论进行验证。