金银花提取物绿原酸对链球菌感染的小鼠模型凝血和炎症相关指标的影响

洪灵杰，刘完美，应瀚霆，彭可昕，陈程，时欢，姚雨涵，段文彧

（长沙医学院，湖南长沙 410219）

溶血性链球菌由Billrth于1877年发现，是与人类感染密切相关的病原菌。因溶血性链球菌感染造成的临床疾病种类繁多，不同感染部位、感染特征的患者，其治疗措施均有一定差别。目前，抗生素滥用形势依然严峻，从食材或中药材角度挖掘或研发新型药物至关重要[1]。绿原酸（Chlorogenic Acid，CGA）是酚酸化合物中抗菌效果最为显著的酸类物质，广泛存在于绿咖啡和茶中[2]。金银花（又称忍冬）很早就被用于治疗各种热性病，如身热、热毒疮痈、咽喉肿痛以及发疹等，但是关于其药效发挥的机制研究直到现代才被发现和深入研究[3-4]。已有研究证实，金银花中富含CGA，高纯度CGA能有效治疗流感病毒、病毒性心肌炎、呼吸道感染和疱疹病毒。此外，CGA还是一种常见的生物活性膳食多酚，其主要功效为抗氧化、抗炎症、解热以及保护神经，而最新研究显示其还具有一定的抗菌功效[5]。本文对80只健康成年小鼠进行了对照实验研究，旨在探究金银花提取物绿原酸干预链球菌感染模型小鼠对血清炎症指标表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由长沙医学院动物实验中心提供（清洁级）健康成年小鼠80只，雌性小鼠40只，雄性小鼠40只，体重在160～180 g。实验室模拟光照和黑暗场景各12 h交替进行饲养，实验室室温控制为22～25 ℃，湿度控制为43%～55%。

1.2 仪器与试剂

BS-2000M型全自动生化分析仪，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；TSA8000型全自动凝血分析仪，美德太平洋（天津）生物科技股份有限公司。

乙醇，试剂纯，东莞市勋业化学试剂有限公司；盐酸，试剂纯，上海纯优生物科技有限公司；乙酸乙酯，试剂纯，天津市永大化学试剂有限公司；氢氧化钠，分析纯，南京化学试剂股份有限公司；聚酰胺；分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇，试剂纯，国药集团化学试剂有限公司；生理盐水，上海远慕生物科技有限公司。

1.3 实验方法

将小鼠分为模型组和CGA组，每组各40只，保持两组小鼠的生活环境和饮食等条件完全相同一周后，将乙型溶血性链球菌用注射器分别注入模型组和CGA组的小鼠体内。溶血性链球菌感染潜伏期在3个月左右，其主要症状为咽痛、寒颤、发热、恶心呕吐、咽部肿大、扁桃体肿大以及颈部淋巴结肿大。当两组小鼠出现发热、寒颤、恶心、呕吐以及动作频繁等症状时，用注射器吸取适量生理盐水，注入模型组小鼠体内；用注射器吸取适量CGA水溶液（剂量5 mg/kg）注入CGA组小鼠体内。

CGA提取方法：（1）称取金银花50 g加入到1 000 mL的圆底烧瓶中，并加入500 mL（10倍量）70%的乙醇，于75 ℃冷凝回流3 h，倒出液体，再用400 mL（8倍量）、400 mL（8倍量）回流2次，每次2 h，过滤，合并滤液，然后在80 ℃条件下浓缩滤液或者用旋蒸仪旋干滤液至无醇味。（2）分离纯化。以浓度为6 mol/L的盐酸溶液调pH值至3.0左右，以3倍量的乙酸乙酯分3次萃取，合并萃取液（乙酸乙酯层），以5%的氢氧化钠溶液调萃取液pH至8.0左右，分取水层减压浓缩。用聚酰胺拌样，用聚酰胺（80～100目）装柱（用量大概为绿原酸粗品的5倍），装入柱径与柱长比为1∶7的层析柱中，常压下用10%的乙醇作为洗脱剂洗脱，收集流分，点样与标准品对照（标准品用50%的甲醇溶解，0.2 mg/mL），合并相同流分，旋干即为所要提取的绿原酸。使用时，将提取的绿原酸稀释到5 mg/kg浓度，现配现用。

1.4 指标测定

用全自动生化检测仪定量检测C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）含量。用全自动凝血分析仪测定白细胞计数（White blood cell count，WBC）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）水平。

1.5 统计分析

用SPSS 19.0统计分析。两组计量资料进行正态性检验后进行t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 两组小鼠凝血功能相关指标的比较

由表1可知，CGA组FIB含量低于模型组，PT、APTT、TT高于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明金银花提取物CGA干预后的模型组其凝血功能各项指标均有积极好转，这是因为CGA可在一定程度清除和抑制溶血性链球菌的生长和繁殖，从而缓解血小板的异常活化，最终改善小鼠凝血功能，同时其对小鼠凝血功能的影响可能还与其有效缓解内皮细胞损伤，最终积极改善血小板聚集有关。

表1 两组小鼠凝血功能相关指标的比较（±s）

表1 两组小鼠凝血功能相关指标的比较（±s）

组别 PT/s FIB/（g/L） APTT/s TT/s模型组（n=40）9.51±1.29 4.51±0.84 22.17±4.02 15.04±1.96 CGA组（n=40）12.04±1.63 2.60±0.32 28.69±4.71 17.82±2.34 t 7.697 13.438 6.659 5.760 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 两组小鼠血清炎症相关指标的比较

由表2可知，CGA组小鼠CRP含量高于模型组，IL-6、TNF-α、IL-1β、WBC含量低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。IL-6是由T淋巴细胞、成纤维细胞等分泌产生的一种促炎细胞因子，在炎症初期IL-6会在病变位置大量合成并且由血液进入肝脏，诱导机体在短时间内大量合成CRP、SAA等相关蛋白[6]。具体分析CGA组小鼠IL-6的变化特征，主要与CGA作为AMPK/Nrf2通路的激活剂，通过抑制NF-κB、JAK-1、STAT-1和MAPK通路的磷酸化，从而对脂多糖诱导作用进行抑制，达到抑制急性和慢性炎症反应作用有关。此次研究中发现溶血性链球菌感染会导致小鼠血清中IL-6明显升高，CGA干预后IL-6的表达降低，CGA降低IL-6表达效果好，说明CGA具有较强的抗炎作用。同时，链球菌感染小鼠模型制作过程中，溶血性链球菌感染会导致体内促炎因子如IL-6和TNF-α和iNOS大量增加，互相促进导致炎症因子的进一步增加，从而损害体内各个器官。尤其是TNF-α作为免疫系统的主要调节因子，通过其TNFR1激活和召集免疫细胞，在炎症的传播中发挥重要作用。而CGA主要作用于机体免疫系统，能有效增强免疫系统能力，对上皮淋巴细胞和肠道固有层淋巴细胞中INF-γ和TNF-α水平有一定影响。因此，CGA对链球菌感染小鼠发挥抗炎影响的机制不局限于信号通路，还可影响人体免疫功能的渐变或强化，最终发挥干预效果。

表2 两组小鼠血清炎症相关指标的比较（±s）

表2 两组小鼠血清炎症相关指标的比较（±s）

组别 CRP/（μm/mL） IL-6/（ng/L） TNF-α/（ng/L） IL-1β/（pg/mL） WBC/（×109/L）模型组（n=40） 45.63±2.51 75.54±5.01 68.16±4.27 75.26±6.33 14.75±2.17 CGA 组（n=40） 51.86±2.76 60.14±4.55 51.32±3.19 55.24±4.17 12.36±1.63 t 10.561 14.391 19.982 16.704 5.569 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 讨论

基于其药理和生理层面的优异表现，可尝试将该药材作为药食同源食材进行推广应用。但是该研究亦有一定不足之处，仅进行了空白组和实验组的设计，缺乏条件对照组，因此仅能验证CGA对链球菌感染的干预效果，但无法同其他抗炎或抗菌药物的效果进行组间比较。

3 结论

本研究通过溶血性链球菌感染的小鼠模型，探究了金银花提取物绿原酸对小鼠凝血功能和炎症反应相关指标的影响。结果表明，绿原酸可有效改善溶血性链球菌感染小鼠的凝血功能和炎症反应。