氯化镧通过低氧诱导因子1信号通路抑制高磷诱导的人血管平滑肌细胞钙化

王琪雯，赵璐璐，元晓荣，高 原，王鲁豫，张春生，谷 超，李 刚

（内蒙古医科大学药学院药理学教研室，内蒙古 呼和浩特 010110）

血管钙化是慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）、动脉粥样硬化、糖尿病和高血压患者最常见的并发症之一，也是导致CKD晚期患者死亡的主要原因[1-3]。血管中膜钙化是CKD患者最常见的钙化类型，常伴随着羟基磷灰石沉积导致的异位矿化和弹性纤维断裂[4]。传统观念认为，血管钙化是一种被动的过程，然而，越来越多的研究表明，血管钙化是一个主动、可调节、可预防的过程[5-7]。有研究表明，在高磷条件下，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）能向成骨样细胞转化，表达成骨细胞表型基因，转化后的VSMC可促进胞内钙离子和磷酸盐沉淀，形成无定形磷酸钙，磷酸钙晶体不断生长进一步形成羟基磷灰石，引起VSMC钙化[6]。所以，抑制VSMC成骨转化就成了抑制其钙化的关键一步。

越来越多的证据表明，低氧与钙化之间存在密切联系[8]。低氧诱导因子 1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）途径是细胞对低氧环境下体内稳态反应的主要调节剂。HIF-1α是HIF-1通路的关键性调节蛋白，该蛋白会在细胞低氧时大量产生。有研究表明，在2型糖尿病患者的血管组织中，HIF-1α的表达水平与其血管钙化程度呈正相关[9-11]。此外，有研究发现在患有瓣膜疾病患者狭窄瓣膜的钙化区域中，存在HIF-1α的大量聚集[10]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是体内一类氧的单电子还原产物，其主要是在线粒体电子传递链由状态Ⅲ向状态Ⅳ转换时产生，线粒体高O2的环境下，高还原态的呼吸链有电子由呼吸链底物端和氧端漏出，并交给O2，而生成ROS。ROS产生的增加在缺氧驱动的细胞反应中起关键作用，在缺氧条件下，线粒体生成的ROS可以使HIF-1α在胞质中大量聚集[11]。此外，有研究证实，在血管钙化的模型动物中和人钙化主动脉瓣中均检测到ROS大量产生，抑制线粒体ROS的产生可显著抑制高磷诱导的VSMC向成骨细胞转化，减少成骨相关蛋白表达[12-14]。另有研究发现，肺动脉高压患者肺动脉钙化明显增加，动脉组织HIF-1α和成骨相关转录因子2（runtrelated transcription factor 2，Runx2）蛋白表达升高，表明HIF-1α的激活促进了Runx2表达的增加[15]。

镧，是一种金属稀土元素。早在1980年就有研究发现，给高脂家兔和猴口服氯化镧（LaCl3）有预防动脉粥样硬化的作用[16]。另有研究发现，LaCl3能逆转高胆固醇血症引起的AS损伤[17]。近年来，随着对含镧化合物治疗血管钙化机制研究深入展开，人们发现镧具有类钙性，并赋予其“超级钙”的美称。有研究证明，进入体内的镧离子（La3+）可模拟钙离子激活钙敏感受体，从而抑制牛血管平滑肌细胞向成骨细胞转化以及敲除ApoE基因小鼠动脉粥样硬化的发生[18]。也有研究证明，La3+还可以抑制β-甘油磷酸酯诱导的大鼠血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化，及其异位矿化[19]。

本研究采用高磷诱导的人VSMS（human VSMS，hVSMC）钙化模型，基于高磷环境下ROS所致的HIF-1α入核及其下游靶基因Runx2和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，vegf）的激活，以及hVSMC中骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）和平滑肌22α（smooth muscle 22 alpha，SM22α）的表达，探究LaCl3对高磷诱导hVSMC钙化的影响，旨在为血管钙化的治疗提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和主要仪器

DMEM培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），美国Gibco公司；胰酶和PBS缓冲液粉末，中国Coolaber公司；LaCl3、二甲基乙二酰氨基乙酸（dimethyloxalylglycine，DMOG）和焦磷酸盐（pyrophosphate，PPI），德国Sigma公司；茜素红S染色液、Von Kossa染色液、HE染色液、甘氨酸和Tris，中国Solarbio公司；钙含量测定试剂盒、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒和RIPA裂解液，中国Beyotime Biotechnology公司；ROS化学荧光测试盒，南京建成生物工程研究所；总RNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；Rever-Tra Ace qPCR RT Kit和SYBR Green Realtime PCR Master Mix，日本ToYoBo Life Science公司；四甲基乙二胺，迈新生物开发公司；细胞核和细胞质提取试剂盒，美国ThermoFisher公司；5×蛋白上样缓冲液，北京普利莱基因技术有限公司；小鼠抗人BMP-2/4单克隆抗体、小鼠抗人SM22α单克隆抗体、小鼠抗人VEGF单克隆抗体、小鼠抗人Runx2单克隆抗体和兔抗人β肌动蛋白多克隆抗体及远红外DyLight 800荧光标记的山羊抗兔IgG抗体，美国Santa Cruz Biotechnology公司；小鼠抗人HIF-1α单克隆抗体，英国Abcam公司；兔抗人核纤层蛋白A/C多克隆抗体，美国Proteintech公司；远红外DyLight 800荧光标记的山羊抗小鼠IgG抗体，美国Abbkine公司。

AG-245分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；Thermo-KS12生物安全柜、二氧化碳培养箱、-80℃超低温冰箱和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）仪，均美国Thermo Fisher公司；倒置荧光显微镜，德国Leica公司；Molecular Devices多功能酶标仪，美谷分子仪器有限公司；台式高速冷冻离心机，德国Sigma公司；超纯水机，四川优普超纯科技有限公司；超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；Bio-Rad基础电泳仪，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；Odyssey红外激光成像系统，美国LI-COP公司；金属浴，北京天根生化公司。

1.2 细胞和细胞培养

hVSMC购自上海钰博生物科技有限公司，在含有10% FBS和1%青链霉素的高糖DMEM培养基中，于37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞生长至融合后，选择第5～7代细胞用于实验。

1.3 钙化模型建立和细胞分组

对数生长期hVSMC，以每孔2×105密度接种于6 孔板中，分为细胞对照组、LaCl360 μmol·L-1组、高磷模型组（磷酸盐缓冲液3 mmol·L-1）、模型+NaCl180 μmol·L-1组、模型+LaCl315，30和60 μmol·L-1组、模型+DMOG 100 μmol·L-1+LaCl360 μmol·L-1组、模型+PPI 100 μmol·L-1组。除细胞对照组和LaCl360 μmol·L-1组外，其余各组hVSMC加磷酸盐缓冲液3 mmol·L-1诱导钙化6 d。第4天时，除细胞对照组和 LaCl360 μmol·L-1组外，其余各组按分组给予不同浓度的 LaCl3，NaCl，DMOG 或 PPI，继续孵育2 d，隔天换液1次。

1.4 茜素红染色检测hVSMC钙沉积

取1.3分组处理的细胞，用PBS（pH 7.2～7.4）洗涤细胞，每孔加入2 mL 4%多聚甲醛在37℃下固定30 min。弃掉多聚甲醛溶液，再次用PBS洗涤细胞，每孔加入1 mL 1%茜素红S染液（pH 4.2）于37℃下染色5 min，弃茜素红S染色液并用PBS多次洗涤，直到茜素红S染液被洗至无明显浮色。在显微镜下拍摄染色照片，观察被染成红色的钙沉积。拍摄照片后，用10%乙酸对钙沉淀物充分脱色，用多功能酶标仪于420 nm波长处检测吸光度值（A420nm），反映钙沉积程度。

1.5 Von Kossa染色观察hVSMC钙沉积

取1.3分组处理的细胞，用PBS（pH 7.2～7.4）洗涤细胞，每孔加入2 mL 4%多聚甲醛在37℃下固定30 min。用PBS洗涤3次，加入Von Kossa染色试剂盒的试剂A处理细胞，并置于紫外线下30 min直到磷酸钙变成黑色，用PBS洗涤3次以除去过量的染料。加入硫代硫酸钠处理细胞2 min，用PBS洗涤3次。细胞质用伊红染色液复染。在显微镜下拍照，观察被染成黑色的钙沉积。

1.6 邻甲酚酞络合酮比色法检测hVSMC中钙含量

试剂盒采用邻甲酚酞络合酮比色法，通过钙离子与邻甲酚酞络合酮在碱性条件下反应产生紫色复合物，用酶标仪在波长575 nm处检测吸光度值（A575nm），定量检测钙离子含量。取1.3分组处理的细胞，用 PBS（pH 7.2～7.4）洗涤细胞3次，使用HCl 0.6 mol·L-1在37℃下脱钙24 h，而后取上清液。再次使用PBS洗涤细胞3次，每孔加入500 μL含0.1%SDS和NaOH 0.1 mol·L-1的溶液溶解30 min，收集全部液体。使用BCA蛋白检测试剂盒测定细胞中蛋白质含量。使用钙含量测定试剂盒测定细胞钙含量，以mg·g-1蛋白质表示。

1.7 试剂盒检测hVSMC中ALP活性

取1.3分组处理后的细胞，用PBS（pH 7.2～7.4）洗涤3次，在冰上每孔加入P0013J（无磷酸酶抑制剂）裂解液150 μL孵育30 min。细胞裂解后，使用BCA蛋白检测试剂盒测量细胞中的蛋白质含量，使用ALP试剂盒测定细胞ALP活性，以kU·g-1蛋白质表示ALP的活性。

1.8 荧光染色法检测hVSMC中ROS含量

取1.3分组处理后的细胞，用PBS（pH 7.2～7.4）洗涤3次；加入ROS荧光探针（DCFH-DA），使其每孔终浓度为 10 μmol·L-1，于 37℃下孵育 30 min，用PBS（pH 7.2～7.4）洗涤3次，在荧光倒置显微镜下按FITC荧光检测条件进行检测。用Image Jv1.8.0软件对每组细胞荧光强度进行半定量分析，以反映细胞中ROS含量。实验重复3次。

1.9 RT-qPCR 法检测 hVSMC 中 sm22 α，bmp-2，runx2和vegf mRNA表达水平

取1.3分组处理的细胞，按总RNA提取试剂盒说明书操作，提取总RNA并将其逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行扩增，引物序列如表1所示。RT-qPCR反应体系组成如下：cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，无RNase水6.4 μL。设定qPCR仪程序为：95℃，30 s；40个循环：（95℃，5 s；60℃，10 s；72℃，15 s）；采集数据；熔解曲线55℃～95℃；采集数据；20℃，10 s。反应结束后，根据反应得到的熔解曲线，分析qPCR产物的特异性。采用2-△△CT原理定量目的基因相对表达量。以稳定表达的基因β肌动蛋白作为内参。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.10 Western印迹法检测hVSMC细胞质和细胞核中蛋白表达水平

取1.3分组处理后的细胞，6孔板中每孔加入裂解液RIPA缓冲液200 μL，在冰上裂解5 min，吹打使细胞充分裂解，分别收集每孔的裂解液置1.5 mL EP管中，4℃下13 201×g离心10 min，收集上清液，于-20℃保存备用。核蛋白和胞质蛋白的提取按试剂盒说明书操作。采用BCA蛋白定量分析试剂盒测定每组细胞总蛋白浓度。蛋白100℃加热煮沸使其变性，蛋白变性后进行SDS-PAGE电泳，转膜，使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入相应一抗（BMP-2/4，1∶600；SM22α，1∶500；HIF-1α，1∶5000；VEGF，1∶600；Runx2，1∶600；核纤层蛋白A/C，1∶1000；β肌动蛋白，1∶2000）于4℃下孵育过夜，TBST缓冲液洗膜后，加入相应二抗（1∶5000）于37℃下避光孵育1 h；TBST缓冲液洗膜后，置于红外激光成像系统下成像。用Image Jv1.8.0软件进行分析，检测胞质中BMP2，SM22α，VEGF和HIF-1α蛋白表达水平，以目标蛋白与内参β肌动蛋白积分吸光度值比值反映目标蛋白表达水平；同时检测细胞核中HIF-1α和Runx2蛋白表达水平，以目标蛋白与内参核纤层蛋白A/C积分吸光度值比值反映目标蛋白表达水平。实验重复3次。

1.11 统计学分析

实验数据结果用±s表示，采用SPSS 22.0和Graphpad Prism 8.0统计软件包进行数据分析及作图。多组间差异采用单因素方差分析，两组间采用Dunnettt检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LaCl3对高磷诱导的hVSMC钙沉积的影响

2.1.1 茜素红染色

茜素红染色结果如图1A所示，高磷模型组红色钙沉积物体积大且大量聚集，模型+LaCl315，30和60 μmol·L-1组中红色钙沉积物体积较小且分布较为稀疏，其中模型+LaCl330 和 60 μmol·L-1组红色钙沉积物分布最为稀疏。定量结果如图1B所示，与正常对照组相比，高磷模型组和模型+NaCl组A420nm值显著升高（P＜0.01）；与高磷模型组相比，模型+LaCl315，30 和 60 μmol·L-1组A420nm值均明显降低（P＜0.05，P＜0.01），模型+PPI 100 μmol·L-1组A420nm值也明显降低（P＜0.01）；与模型+LaCl360 μmol·L-1组相比，模型+DMOG 100 μmol·L-1+LaCl360 μmol·L-1组A420nm值明显升高（P＜0.01）。表明LaCl3可抑制高磷诱导的hVSMC钙沉积。

Fig.1 Effect of LaCl3on calcification of human vascular smooth muscle cells（hVSMCs）induced by high concentration phosphate by Alizarin red staining.Except for the cell control group and LaCl360 μmol·L-1group，hVSMCs in other groups were added with phosphate buffer 3 mmol·L-1to induce calcification for 6 d.Then on the 4thday，LaCl315，30，60 μmol·L-1，NaCl 180 μmol·L-1，dimethyloxalamido acetic acid（DMOG）100 μmol·L-1and pyrophosphate（PPI）100 μmol·L-1 were added to the groups except for the cell control group and incubated for 2 d.Arrows in Fig.A show calcifications stained red.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group；△△P＜0.01，compared with model+LaCl360 μmol·L-1group.

2.1.2 Von Kossa染色

Von Kossa染色结果如图2所示，高磷模型组黑色钙沉积物大量聚集并广泛分布，模型+LaCl315，30和60 μmol·L-1组钙沉积物分布较为分散且体积较小，表明LaCl3可改善高磷诱导的hVSMC钙沉积。

Fig.2 Effect of LaCl3on hVSMC calcification induced by high concentration phosphate by Von Kossa staining.See Fig.1 for the cell treatment.Arrows show calcifications stained black.

2.2 LaCl3对高磷诱导的hVSMC钙含量的影响

如表2所示，与细胞对照组相比，模型组钙含量显著升高（P＜0.01）；与高磷模型组相比，模型+LaCl315，30和60 μmol·L-1组钙含量显著降低（P＜0.01），模型+PPI 100 μmol·L-1组钙含量也明显降低（P＜0.01）；与模型+LaCl360 μmol·L-1组相比，模型+DMOG+LaCl360 μmol·L-1组钙含量显著升高（P＜0.01）。表明LaCl3可通过抑制HIF-1信号通路从而抑制hVSMC中钙含量的增加。

Tab.2 Effect of LaCl3on calcium content in hVSMCs induced by high concentration phosphate

2.3 LaCl3对高磷诱导的hVSMC ALP活性的影响

如表3所示，高磷模型组ALP活性约为细胞对照组的6倍（P＜0.01）；与高磷模型组相比，模型+LaCl315，30和60 μmol·L-1组ALP活性显著降低（P＜0.05，P＜0.01），模型+PPI 100 μmol·L-1组ALP活性也显著降低（P＜0.01）；与模型+LaCl360 μmol·L-1组相比，模型+DMOG+LaCl360 μmol·L-1组ALP活性显著升高（P＜0.01），表明LaCl3可通过抑制HIF-1信号通路抑制hVSMC中ALP活性升高。

Tab.3 Effect of LaCl3on alkaline phosphatase（ALP）activity in hVSMCs induced by high concentration phosphate

2.4 LaCl3对高磷诱导的hVSMC内ROS含量的影响

如图3所示，与细胞对照组相比，高磷模型组ROS的产生显著增加（P＜0.01）；与高磷模型组相比，模型+LaCl315，30和 60 μmol·L-1组ROS产生均显著减少（P＜0.05，P＜0.01），模型+PPI 100 μmol·L-1组ROS产生也显著减少（P＜0.01）；与模型+LaCl360 μmol·L-1组相比，模型+DMOG+LaCl360 μmol·L-1组ROS的产生显著增加（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of LaCl3on reactive oxygen species（ROS）content in hVSMCs induced by high concentration phosphate.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group；△P＜0.05，compared with model+LaCl360 μmol·L-1group.

2.5 LaCl3对高磷诱导的hVSMC中HlF-1信号通路相关蛋白mRNA表达的影响

如表4所示，与细胞对照组相比，高磷模型组sm22αmRNA表达水平明显下降（P＜0.01），bmp-2，runx2和vegfmRNA的表达明显升高（P＜0.01）；与高磷模型组相比，模型+LaCl315，30和60 μmol·L-1组及模型+PPI 100 μmol·L-1组sm22αmRNA表达水平明显升高（P＜0.05，P＜0.01），bmp-2和runx2mRNA表达水平均明显降低（P＜0.05，P＜0.01），模型+LaCl330 和 60 μmol·L-1组及模型+PPI 100 μmol·L-1组vegfmRNA 表达均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型+LaCl360 μmol·L-1组相比，模型+DMOG+LaCl360 μmol·L-1组runx2mRNA 表达升高（P＜0.05），而sm22α，bmp-2和vegfmRNA的表达均无显著性差异。

Tab.4 Effect of LaCl3on mRNA expressions of sm22 α，bmp-2，runx2 and vegf in hVSMCs induced by high concentration phosphate

2.6 LaCl3对高磷诱导的hVSMC胞质和胞核中HlF-1信号通路蛋白表达的影响

如图4所示，与细胞对照组相比，高磷模型组hVSMC胞质中BMP-2和VEGF蛋白表达明显升高（P＜0.01），SM22α和HIF-1α蛋白表达明显降低（P＜0.01）；与高磷模型组相比，模型+LaCl315 μmol·L-1组细胞质中BMP-2，VEGF，SM22α和HIF-1α蛋白表达水平均无显著性差异，而模型+LaCl330和60 μmol·L-1组及模型+PPI 100 μmol·L-1组细胞质中BMP-2和VEGF蛋白表达均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），SM22α和HIF-1α蛋白表达均显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型+LaCl360 μmol·L-1组相比，模型+DMOG+LaCl360 μmol·L-1组细胞质中BMP-2，VEGF和HIF-1α蛋白表达均无显著性降低差异，SM22α蛋白表达显著降低（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of LaCl3on protein expressions of hypoxia-inducible factor-1（HlF-1）signaling pathway in cytoplasme of hVSMCs induced by high concentration phosphate by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B-E were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group；△P＜0.05，compared with model+LaCl360 μmol·L-1group.

如图5所示，与细胞对照组相比，高磷模型组细胞核内的HIF-1α蛋白和Runx2蛋白表达显著升高（P＜0.01）。与高磷模型组相比，模型+LaCl330 和60 μmol·L-1及模型+PPI组 HIF-1α 和Runx2蛋白显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型+LaCl360 μmol·L-1组相比，模型+DMOG+LaCl360 μmol·L-1组HIF-1α和Runx2蛋白蛋白表达均无显著性差异。

Fig.5 Effect of LaCl3on protein expressions of HlF-1 α and related transcription factor 2（Runx2）in nucleus of hVSMCs induced by high concentration phosphate by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B and C were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 讨论

本研究结果表明，镧对于高磷诱导的hVSMC钙化有明显的改善作用，茜素红染色和Von Kossa染色结果显示，LaCl3可显著减少高磷诱导的hVSMC钙沉积，LaCl360 μmol·L-1作用最为显著。此外，LaCl3可显著下调高磷诱导的hVSMC中BMP-2 mRNA和蛋白的表达，上调SM22α mRNA和蛋白表达，表明LaCl3可明显抑制hVSMC的成骨转化，其中LaCl360 μmol·L-1的抑制作用最为显著。本研究还通过荧光染色发现，LaCl3可显著减少高磷所致的hVSMC中ROS含量增加。然而LaCl3对ROS聚集所致的线粒体氧化应激途径是否也产生影响还需进一步探究。

HIF-1α是HIF-1信号通路的关键性调控蛋白[20-23]。本研究发现，高磷所致的HIF-1α入核，激活其下游靶基因runx2发挥促进钙化的作用，可被LaCl3显著抑制。为明确LaCl3的这一抑制作用，实验加入了HIF-1α的激动剂DMOG与 LaCl360 μmol·L-1共孵育hVSMC，并通过Western印迹法对不同组别hVSMC胞质和胞核中的HIF-1α蛋白表达进行检测，结果表明，与高磷模型组相比，LaCl3可显著增加HIF-1α在hVSMC胞质中的表达，降低其在胞核中的表达，进一步证实了LaCl3可抑制HIF-1α入核，阻断HIF-1通路，从而发挥抑制hVSMC钙化的作用。

为明确La3+发挥抑制hVSMC钙化的作用，本实验在组别设置中除常规的给药组和阳性药组外，还加入了 LaCl360 μmol·L-1组和模型+NaCl 180 μmol·L-1组。结果表明与细胞对照组相比，LaCl360 μmol·L-1组钙含量、ALP 相对活性、ROS的产生、各基因及其蛋白表达均无显著变化；与高磷模型组相比，模型+NaCl 180 μmol·L-1组钙沉积、钙含量、ALP相对活性、ROS的产生、各基因及其蛋白表达也均无显著变化。排除了La3+对hVSMC钙化的诱导作用及Cl-对钙化的影响。

综上所述，本研究结果显示，LaCl3可抑制高磷导致的hVSMC中ROS的大量产生，抑制HIF-1α在胞质中的大量聚集，从而抑制HIF-1α入核激活下游靶基因，抑制了hVSMC的成骨转化和钙化的发生。然而，关于La3+是通过何种途径进入细胞及La3+进入细胞后是否还可以通过其他生物途径发挥抑制钙化的作用，还有待进一步研究。