三种不同灭活剂对猪细小病毒和猪圆环病毒的灭活效果研究

张春玲,赵本进,曹昌健,王瑞阳,钱忠辉,张俊平,葛宇燕,丁卫星

(上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海 201106)

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一[1-2],其主要临床表现为母源性繁殖障碍,同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻[3-4]。近几年来,PPV的流行出现了一些新的特点,PPV常常与PCV2、PRRSV、PRV中的一种或几种病毒发生混合感染,使得病情复杂化,给临床诊断和防控带来了困难[5-7]。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是已知的最小的动物病毒之一,由于其攻击猪体的免疫系统,造成猪体免疫功能低下,抵抗力降低,进一步导致其他病原的继发或混合感染[8]。PCV2被公认为是引起断奶仔猪多系统消瘦综合症(PMWS)的主要病原,而PPV可刺激免疫系统,促进PCV2的增值,增强PCV2引起的PMWS,造成疫病的严重化[9-10]。

对于PPV和PCV2引起的各种疾病,目前国内外主要运用疫苗免疫预防,灭活疫苗因具有较好的安全性在防控中发挥着重要作用。在灭活疫苗的生产过程中,对病原微生物的灭活是整个过程中最关键、最基础的部分。良好的灭活剂不仅有利于防止病原微生物感染,同时应保留病原微生物良好的免疫原性,提高生物制剂的作用效果[9]。本试验采用甲醛、β-丙内酯(BPL)和二乙烯亚胺(BEI)灭活PPV(S-1株)和PCV2(JSM株),探索3种灭活剂对PPV、PCV2的灭活效果,筛选最佳灭活参数,旨在为进一步研制PPV、PCV2灭活疫苗单苗以及二联灭活疫苗奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 毒株及细胞

猪细小病毒(S-1株)、猪圆环病毒2型(JSM株)、ST细胞、PK-15细胞、猪细小病毒抗原均由上海佳牧生物制品有限公司保存。

l.2 主要试剂

甲醛(分析纯)、二乙烯亚胺(BEI)、硫代硫酸钠购自中国医药集团有限公司化学试剂上海有限公司;β-丙内酯购自德国Serva公司;豚鼠红细胞悬液采自健康成年豚鼠(豚鼠购自上海生物制品研究所);硫乙醇酸盐流体培养基(TG)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)、酪胨琼脂培养基(GA)均购自北京中海生物科技有限公司。MEM和DMEM购自美国GIBCO公司;胎牛血清购自内蒙古金源康生物工程股份有限公司。抗PCV2 Cap单克隆抗体购自韩国MEDIAN Diagnostics公司;羊抗鼠荧光二抗购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司,D-氨基葡萄糖购自中国医药集团有限公司。

1.3 灭活前病毒含量的测定

使用不含血清的细胞培养液将灭活前的PPV(S-1株)和PCV2(JSM株)病毒液进行10倍稀释,取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度,分别接种生长良好的ST和PK-15单层细胞,每个稀释度接种8个孔,每孔0.1 mL,在37℃、5% CO2培养箱孵育1 h。取出培养板,吸出病毒液,加入200μL含2%胎牛牛血清的细胞维持液,继续培养72 h。收获接种PPV(S-1株)的ST细胞,反复冻融3次。测定HA,HA≥25(微量法)者判为感染,计算PPV(S-1株)TCID50;通过IFA检测接种PCV2(JSM株)的PK-15细胞,细胞有特异性荧光者判为感染。

1.4 病毒的灭活

1.4.1 甲醛灭活

40%的甲醛溶液经无菌PBS稀释后,缓慢加入含500 mL病毒液的三角瓶中,充分混匀,使其浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%、0.3%。37℃恒温灭活,每隔一段时间摇匀一次,分别在24 h、36 h、48 h、60 h取样一次。取样后,所有样品均4℃保存,用于共同检测HA活性、无菌检验及灭活检验。

1.4.2 BEI灭活

将10%的BEI溶液缓慢加入到病毒液中,使其终浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%、0.3%,32℃恒温灭活,每隔一段时间摇匀一次,分别在24 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h取样一次,以总体积1∕10的硫代硫酸钠终止灭活。取样后,所有样品均4℃保存,用于共同检测HA活性、无菌检验及灭活检验。

1.4.3 BPL灭活

取PPV、PCV2病毒液500 mL分别置于三角瓶中,加入β-丙内酯,使其终浓度分别为0.03%、0.04%、0.05%、0.06%。4℃恒温灭活,每隔一段时间摇匀一次,分别在24 h、36 h、48 h、72 h、96 h取一次样,37℃、2 h终止灭活。取样后,所有样品均4℃保存,用于共同检测HA活性、无菌检验及灭活检验。

1.5 灭活检验

将采集到的灭活病毒液分别接种ST细胞和PK-15细胞,收获盲传3代的细胞培养物,通过HA和IFA试验判定灭活结果。

1.5.1 HA测定

按现行《中国兽药典》附录中HA试验方法,对收获的灭活样品进行HA效价测定,同时设置病毒灭活前以及健康细胞对照。

1.5.2 IFA试验

将收集的灭活后PCV2样品,以10的倍比稀释倍数与PK-15细胞同步接种于96孔板,72 h后,弃培养液,无菌PBS洗涤3次,每孔加入150μL预冷的70%乙醇溶液固定液,常温固定10 min,弃固定液,室温风干5—10 min,无菌PBS洗涤3次,每孔加入50μL以无菌PBS 1∶200稀释的PCV2 Cap蛋白单抗,37℃孵育1 h。无菌PBS洗涤3次,每孔加入50μL以无菌PBS 1∶100稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育1 h。无菌PBS洗涤3次,每孔加入100μL无菌PBS,置于荧光显微镜下观察。

1.6 无菌检验

参照现行《中国兽药典》附录中无菌检验方法,取收获的灭活样品接种TG小管和GA斜面各2支,每支0.2 mL,1支置于35—37℃培养,1支置于23—25℃培养;另取0.2 mL,接种1支TSB小管,置于23—25℃培养,均培养7 d,每日观察培养基状况。

2 结果与分析

2.1 PPV灭活前、后血凝活性(HA)检测

猪细小病毒(S-1株)病毒液灭活前血凝价为211,使用甲醛灭活,随着甲醛浓度、灭活时间的增加,病毒液灭活60 h后血凝价下降至26—25;同批病毒液使用BEI和BPL灭活,灭活剂的浓度、灭活的时长对病毒液血凝价无明显影响,病毒液灭活后的血凝价基本保持不变(图1)。

图1 三种灭活剂对PPV(S-1株)血凝价的影响Fig.1 Effects of 3 inactivators on the hemagglutination value of PPV(S-1 strain)

2.2 灭活检测结果

使用甲醛灭活的病毒液接种细胞后,盲传F1—F2代细胞的生长状况不良,贴壁率低,培养至72 h时约50%的细胞死亡。由表1可见,甲醛浓度与灭活效率成正比,除0.05%的甲醛外,0.1%、0.2%和0.3%的甲醛均可彻底灭活PPV(S-1株)与PCV2(JSM株),未观察到灭活样品细胞培养物接种的细胞出现细胞病变效应(CPE),HA试验于灭活后48 h未检测到血凝活性(HA=20),IFA试验于灭活后36 h未出现特异性荧光(TCID50=100),证明病毒灭活完全。

表1 37℃下甲醛对PPV(S-1株)、PCV2(JSM株)灭活试验结果Table 1 Inactivation results of PPV(S-1 strain)and PCV2(JSM strain)by formaldehyde at 37℃

BEI灭活的病毒液接种细胞后,细胞生长状况良好,与正常健康细胞无明显差异。由表2可见,收获盲传3代接毒细胞培养物,经HA试验,除0.05%灭活组外,其余处理均在灭活后80 h有效灭活PPV(S-1株)(HA=20);IFA试验中,所有灭活组均在80 h有效灭活PCV2(JSM株)(TCID50=100),证明灭活完全。

表2 32℃下BEI对PPV(S-1株)、PCV2(JSM株)灭活试验结果Table 2 Inactivation results of PPV(S-1 strain)and PCV2(JSM strain)by BEI at 32℃

BPL灭活的病毒液接种细胞后,细胞生长状况良好,与正常健康细胞无明显差异。由表3可见,收获盲传3代接毒细胞培养物,经HA试验与IFA试验,所有灭活组均可有效灭活PPV(S-1株)(72 h)和PCV2(JSM株)(96 h)。

表3 4℃下BPL对PPV(S-1株)和PCV2(JSM株)灭活试验结果Table 3 Inactivation results of PPV(S-1 strain)and PCV2(JSM strain)by BPL at 4℃

2.3 无菌检验

对采集的所有灭活样品,按照现行《中国兽药典》附录中无菌检验方法进行检验,所有样品均无菌生长,符合药典要求。

3 讨论

灭活疫苗是先对病原微生物进行培养,然后用物理或化学的方法(通常是甲醛、二乙烯亚胺或β-丙内脂)将其灭活。灭活的病原微生物丧失感染的能力,但需保留良好的免疫原性。猪细小病毒病灭活疫苗和猪圆环病毒2型灭活疫苗自应用以来,广泛使用的是甲醛溶液灭活,灭活剂甲醛的使用历史最为悠久,使用经验也比较丰富,但因其具有强刺激性和高致癌性,已经不能满足当前对生物制品高安全性的需求。烷化剂二乙烯亚胺(BEI)和杂环类化合物β-丙内酯(BPL)是另一类高效的病毒灭活剂[11],二者的灭活原理相似,目前已被广泛用于人和动物疫苗的灭活剂。

本试验以传统灭活剂甲醛作对照,用BPL和BEI对猪细小病毒(S-1株)和猪圆环病毒2型(JSM株)进行灭活,通过血凝试验、灭活检验等检测灭活效果。37℃条件下,随着甲醛浓度、灭活时间的增加,PPV(S-1株)血凝价呈现逐渐下降的趋势,由灭活前的211下降至26—25;同批病毒液经BEI和BPL灭活,灭活剂的浓度、灭活的时长对猪细小病毒(S-1株)血凝效价无显著影响,灭活后的病毒液血凝价在211—212。血凝价滴度下降和上升可能的原因,首先与甲醛、BEI、BPL的灭活原理有关,甲醛灭活是与病毒蛋白质的胺基结合,从而形成羟甲基衍生物,或者二羟甲基衍生物,后者进一步再与酰胺发生交联反应[13-14],病毒蛋白质因而变性,这种变性往往是不可逆的,严重破坏病毒衣壳蛋白;BEI、BPL均直接作用于病毒核酸,使其结构发生变化不再具有复制能力,这种变化不影响病毒蛋白成分,最大程度地保留了病毒的抗原性[15-16]。其次,在灭活过程中,病毒液中的细胞进一步被破碎,病毒颗粒得以充分释放,进而提升了灭活后的病毒效价。随剂量增大,温度升高,BEI的灭活效率有递增趋势,但有研究表明,高温状态下的BEI具有一定的毒性[17],28—32℃是其安全有效的温度。终浓度为0.1%的BEI在32℃下,80 h和72 h可有效灭活PPV(S-1株)和PCV2(JSM株)。BPL是一种杂环类化合物,常温下是无色粘稠状液体,高温会降解,影响灭活效率,需要冷冻保存,其在4℃条件下,对病毒具有很强的灭活作用。

在灭活程序中,随着灭活剂浓度的提高、灭活时间的延长,其灭活效果愈加确实。然而,灭活时间并非越长越好,游离状态的灭活剂会持续对抗原产生破坏作用。同时,若游离的灭活剂随疫苗注射到机体后,会产生强烈的刺激作用,表现出机体对疫苗的应激反应[18]。为了减少对抗原的损伤,避免过多的疫苗副反应,在灭活结束后往往添加灭活终止程序:如通过加入焦亚硫酸钠终止甲醛灭活,加入硫代硫酸钠终止BEI灭活,而BPL极易水解,无需添加终止剂,37℃水浴2 h后即可水解为无毒性的人体脂肪代谢产物——β-羟基丙酸。

本研究显示,3种灭活剂均可有效地灭活PPV(S-1株)和PCV2(JSM株),但甲醛对猪细小病毒表面抗原损伤严重。BEI作为灭活剂首先需要经过氢氧化钠进行环化,其次灭活时间较长,延长了企业的生产周期,增加了企业的生产成本,32℃的灭活温度适宜细菌生长,再次加大的企业对无菌控制的压力。BPL以其高效的灭活效率:灭活程序简单,灭活时间短,37℃仅需2 h即可完全水解,无残留,缩短了疫苗的生产周期,提高了经济效益,可作为疫苗企业优选的灭活剂。根据试验数据,结合生产成本和生产周期,本研究制定的对猪细小病毒(S-1株)和猪圆环病毒2型(JSM株)最佳灭活程序为:在4℃条件下,终浓度为0.05%的BPL灭活48 h。