高产乙酸乙酯毕赤酵母筛选及其耐受性能研究

李 群，林 斌，柯 锋，乐细选，杨 强，杨生智，陈申习

（劲牌有限公司劲牌研究院中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北大冶 435100）

乙酸乙酯是清香型白酒中的主体香味成分，其含量的高低直接影响白酒风格和品质[1-2]，在清香型小曲白酒中，较高的乙酸乙酯含量可使酒的香味更加醇和浓郁。经研究发现，在清香小曲白酒实际酿造过程中，乙酸乙酯主要是通过微生物代谢底物产生的，产酯酵母在其中扮演了重要角色[3]。目前在提高清香型小曲白酒中乙酸乙酯含量方面虽取得了一定研究成果，但尚未达到理想的含量，清香型小曲白酒质量仍有很大的提升空间[4]。

据文献报道，产酯能力较强的酵母包括毕赤酵母属（Pichia）、汉逊酵母属（Hansenula）、假丝酵母属（Candida）等。近年来，对产酯酵母研究最多是球拟酵母（Torulopsis）、汉逊酵母（Hansenula）和假丝酵母（Candida）[5-6]。在清香型小曲白酒酿造中，毕赤酵母属中一些优势酵母种类如库德里阿兹威毕赤酵母、发酵毕赤酵母、膜璞毕赤酵母、异常毕赤酵母等，可代谢多种酯类物质，在酿酒行业具有极大的研究价值和应用潜力。库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii），对酿造环境的适应性好，对温度、乙醇、酸度的耐受性强，可代谢产生乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯等多种酯类物质[7]。王勇[8]从牛栏山二锅头酒醅中筛选得到120株酵母菌，对不同酵母发酵代谢产物进行分析，发现库德里阿兹威毕赤酵母具有较高产乙酸乙酯能力。膜璞毕赤酵母（Pichia Membranifaciens）能产生β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和一些挥发性酚类物质，如4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚[9-10]，可以增加原酒的香气。姚翠萍等[11]对膜璞毕赤酵母发酵代谢产物进行分析，发现该菌主要产物为酸、醇、酯以及一些特殊呈香物质，其中，苯乙醇、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸等含量较为丰富，并能产生降低胆固醇和血脂的活性成分亚油酸乙酯。异常毕赤酵母（Pichia anomala），现名异常威克汉逊酵母（Wickerhamomyces anomalus），是白酒中普遍存在的菌种，能高产乙酸乙酯[12]，耐受低pH、低水活度、高渗透压、厌氧等极端环境。张杰等[13]从清香型小曲白酒发酵酒醅中筛选出一种高产乙酸乙酯的异常毕赤酵母，添加该菌株酿造的清香型白酒中乙酸乙酯含量为2.86 g/L，是对照组白酒中乙酸乙酯含量的1.5 倍。发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）高产酯酶，具有较高C4—C8酯酶活性，可增加葡萄酒香味[14]。

随着食品生物技术的发展，越来越多的功能微生物正在改变酿酒方式，通过筛选功能菌株添加到酿造中是一种有效提升白酒品质的方法。鉴于毕赤酵母在清香型小曲白酒发酵中具有较多的种类，但其不同种类及不同株在酿造中的作用尚未研究清晰，结合清香型小曲白酒品质提升需求，本文旨在通过对菌种库不同种毕赤酵母进行产酯筛选和酿造特性研究，以期筛选出性能优良菌株，将其应用于清香型小曲白酒生产中，以期提高酒曲及其酿造质量，改善小曲白酒品质。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 菌种信息

所有菌株均为实验室菌种库保藏菌株，分离自劲牌有限公司酒曲、酿造酒醅，详细信息如表1所示。

表1 45株毕赤酵母菌株信息

1.1.2 仪器与试剂

试剂：葡萄糖、溴甲酚紫、三丁酸甘油酯、硫酸铵、尿素、磷酸二氢铵、硫酸镁，国药集团化学试剂有限公司；β-淀粉酶（酶活50 000 U/g）、糖化酶（酶活100 000 U/g），无锡雪梅酶制剂科技有限公司；蛋白胨、琼脂粉，国药集团化学试剂有限公司；酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限公司；乙醛、甲醇、正丙醇、乙酸乙酯等标准品（均为色谱纯），中国医药集团有限公司。

仪器设备：QHZ-98A 全温振荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂；5424 R 离心机，Eppendorf 公司；WFJ 2000 可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；JJ6000 电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；MJ-250BSH-Ⅱ霉菌培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-1B 净化工作台，苏州智净净化设备有限公司；YXQ-LS-75SII 高压灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；7890A 气相色谱仪，美国Agilent 公司。

1.1.3 培养基

YPD 液体培养基：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L，水1 L，121 ℃高压灭菌20 min。

产酯固体培养基：溴甲酚紫0.04 g/L，三丁酸甘油脂15 mL/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，121 ℃高压灭菌20 min。

高粱汁培养基：1000 g 高粱磨粉，加入5 L 温水，加入5 g 糖化酶、5 g α-淀粉酶，搅拌后放入60 ℃烘箱中保温30 min，后于105 ℃，30 min 高压蒸煮，待冷却至60 ℃，将团块捏碎，再加入5 g 糖化酶、5 g β-淀粉酶，放入60 ℃烘箱中糖化24 h，过滤得滤液，测定糖度，冷冻保藏备用。

酵母麸皮种培养基：麸皮1（以1计），硫酸铵5‰，葡萄糖4%，水60%，于121°C 湿热灭菌20 min。

酵母培养基：称取糖蜜，加入2 倍体积（按糖蜜重量计）的85 ℃热水，搅拌至糖蜜溶解得到溶液，再加入溶液体积0.1%的浓硫酸，搅匀静置12 h，将上层清液加至发酵罐中，并补水至糖蜜培养基的糖度为12 °Bx；按质量比为2 ‰、1 ‰、1 ‰、1 ‰、2‰、10%称取硫酸铵、尿素、磷酸二氢铵、硫酸镁、酵母浸粉和消泡剂并倒入发酵罐中，加水至罐容积的70 %，开启搅拌使营养盐完全溶解，灭菌冷却，即得酵母培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化

从菌种库中挑选不同种类毕赤酵母，取甘油保藏管中100 µL 菌液移入到10 mL YPD 液体管中，于30 ℃、150 r/min 摇床中培养24 h，用接种环沾取培养液在YPD 平板上进行划线分离，30 ℃倒置培养48 h，取一环单菌落接种于YPD 液体培养基中，于30 ℃、150 r/min 摇床中培养24 h 得种子液，放冰箱冷藏备用。

1.2.2 产酯菌株初筛

取一环待测酵母菌株种子液于产酯培养基进行平板划线，培养48 h，观察其菌落颜色。菌株产酯能力不同呈现在产酯平板上的菌落颜色也不相同，菌落黄色越浓，表明菌株的产酯量越多[15]。

1.2.3 产酯菌株复筛

将高粱汁培养基加水调节糖度为10°Bx，分装50 mL 至250 mL 锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min。取活化后的种子液按1%（v/v）的接种量接入培养基中，装上发酵栓，称重，精确至0.01 g，于30 ℃静置发酵7 d。发酵结束后取5 mL 发酵液，8000 r/min离心5 min，取上清液，过0.45 μm滤膜，过滤好的发酵上清液进行气相色谱分析。

1.2.4 酵母麸皮种制备

将待测菌株种子液按2 %（v/v）的接种量接入YPD 液体培养基中，于30 ℃摇床培养24 h。将液体种按40%（麸皮湿重计）的接种量接种于酵母麸皮培养基中，于30 ℃静置培养48 h 后放于30 ℃烘箱烘干，通过血球计数板计数法得知所有固体种酵母数量均达到108CFU/g。将测试菌株固体种与桂花曲按照1∶19（m/m）配比成试验混合曲。

1.2.5 酵母麸皮种扩大培养

按照1 g/100 mL 的比例称取麦芽浸粉，用水溶解后，分装至1000 mL 的三角瓶中，每瓶装液量500 mL，灭菌备用；将酵母种试管纯培养物接入三角瓶中，30 ℃下140 r/min 摇床培养24 h；将培养好的三角瓶接入装有1.1.3 制备的酵母培养基的发酵罐中培养22 h，然后使用圆盘制曲机生产。将发酵罐中菌种液接种到经过灭菌的麸皮培养基中，启动温控系统自动控制圆盘温度在30～32 ℃之间，培养32 h 后，出盘干燥，粉碎，检测细胞数大于10×108CFU/g 为合格。将酵母纯种制剂与公司桂花曲按照1∶19（m/m）比例配成混合曲备用。

图像识别技术是以提取拉铆销位置周围图像的主要特征为基础，并将待识别图像与图像库的有限特征参数进行匹配，从而达到铆接位置识别的目的。计算机图像识别分为离线训练和在线识别两个步骤，每个步骤分别设计了相应的应用程序。程序核心是BP(back propagation)神经网络算法。其中图像特征提取及离线训练方法直接决定了图像识别的准确性。铆接位置识别程序系统框图如图2所示。

1.2.6 固态小试试验

糯高粱经65 ℃水浸泡24 h，浸泡好的粮食放入灭菌锅中进行初蒸（115 ℃，10 min）、焖粮（100 ℃，5 min）、复蒸（111 ℃，10 min）。将复蒸好的粮食冷却至30 ℃，分装进12 号自封袋中，每袋1.05 kg，按干粮重1%的下曲量加入1.2.4 中所制备的混合酒曲，将曲与粮食搅拌均匀，放入培养箱在30 ℃下开口糖化24 h。糖化完成后，按照单个样品500 g 的量称取酒糟，将糖化好的粮食与酒糟按质量比为1∶1 进行混合，混匀后装入气体采样袋，密封，抽真空，放入培养箱于30 ℃发酵7 d，7 d 后将发酵好的酒醅装入特制三角烧瓶中进行蒸馏，取前100 mL酒样进行色谱检测。

1.2.7 中试生产试验[5，16]

按清香型小曲白酒车间生产工艺进行中试生产。糯高粱经75℃水浸泡20 h 后，经过初蒸、焖粮和复蒸得到熟粮，摊晾后下曲（1%），分别接种对照桂花曲和1.2.5 中所制备的混合曲，将曲与粮食搅拌均匀后送至糖化箱场进行培菌糖化，糖化22 h。按照车间生产比例添加配糟，混匀后发酵周期为14 d，发酵结束后蒸馏即得小曲原酒，取100 mL 原酒进行气相色谱检测挥发性风味物质。

1.2.8 气相色谱数据检测

准确移取1 mL酒样于2 mL样品瓶中，加入10 μL三内标使用液（叔戊醇(IS1)：17028.1 mg/L，乙酸正 戊 酯(IS2)：16864 mg/L，2-乙 基 己 醇(IS3)：12104.2 mg/L），盖上瓶盖，摇匀，采用气相色谱法测定原酒中各成分含量。色谱条件为：Agilent 7890A气相色谱仪，检测器FID，CP WAX 毛细管色谱柱（50 m*0.2 μm*0.25 mm）；升温程序：柱温40 ℃保持8 min，以5 ℃/min 升至150 ℃；进 样口温度250 ℃，检测器温度260 ℃，空气、氢气流速比300∶30，载气为氮气，分流比30∶1，柱流量1.0 mL/min；进样方式：自动进样。

1.2.9 菌株耐受性分析[17]

1.2.10 数据处理

使用origin 2016对实验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 产酯酵母筛选

2.1.1 产酯酵母初筛

使用产酯固体培养基对所挑选菌株（编号1—45，其中11 号菌株未成功活化）进行了产酯初筛，结果如表2 所示，外岛毕赤酵母（14、15）、发酵毕赤酵母（26）、盔形毕赤酵母（40）、伯顿丝孢毕赤酵母（43）菌落为深黄色，表明产酯强；发酵毕赤（27、28）、盔形毕赤（32、39）菌落为黄色，表明产酯较强；盔型毕赤酵母（34）伯顿丝孢毕赤酵母（44）菌落为紫色，表明不产酯；其余菌株菌落为浅黄色，表明产酯较弱。

表2 产酯特性筛选结果

2.1.2 产酯酵母液态发酵复筛

对产酯初筛平板上显示为浅黄色、黄色和深黄色菌株均进行了液态发酵复筛。如表3 所示，7 号（Y42）和6 号（Y14）具有最高乙酸乙酯含量，分别为2.81 g/L 和2.67 g/L，24 号（J32）为1.03 g/L,5 号（Y87）为1.00 g/L,4 号（Y10）为0.52 g/L。挑选该5株菌进行后续研究。

表3 不同毕赤酵母液态发酵特征

2.2 产酯毕赤酵母实验室固态实验

为进一步验证复筛产酯酵母菌株对清香型小曲白酒风味影响，对液态复筛选出的5 株酵母，分别为费比恩毕赤酵母（Y10）、异常威克汉逊酵母（Y87、Y14、Y42）和库德里阿兹威毕赤酵母（J32），进行实验室固态酿造实验，实验结果如表4 所示。与对照桂花曲相比，Y10 菌株出酒率有一定提高，增加2.6 %，其他菌株无显著差异；乙醛含量方面，除J32 外，其他菌株相对于桂花曲均有不同程度降低，其中Y87 下降幅度最大，达到54.39 %；甲醇和正丙醇含量与桂花曲相比无明显差异；乙酸乙酯含量方面，除J32 菌株低于对照组外，其余菌株均有不同程度提高，Y10 菌株产乙酸乙酯含量提升最高，达到57.1%；杂醇油含量方面，Y10 菌株低于对照6.5 %，其他菌株与对照无明显差异。综合分析表明菌株Y10 在乙酸乙酯提升方面具有明显的效果。

表4 5株毕赤酵母实验室固态酿造结果

2.3 产酯毕赤酵母中试车间应用研究

为进一步验证毕赤酵母Y10 在清香型白酒中试生产中的应用效果，将Y10 扩大培养制曲，按比例添加至桂花曲中进行发酵，以不添加的桂花曲为对照，每次投粮量1850 kg，连续投料9 批，发酵14 d，结果如表5 所示。与桂花曲相比，Y10 发酵出酒率相当；色谱数据方面，Y10 酿造原酒中乙醛含量提高了12.2 %，甲醇、正丙醇含量均与桂花曲无差异；乙酸乙酯方面，Y10 平均提升了13.7%；杂醇油方面，降低了2.3%。

表5 毕赤酵母Y10中试生产数据结果

2.4 产酯毕赤酵母耐受性分析

白酒发酵过程相对复杂，高温、高糖、高酒精、高渗透压等环境对菌株生长提出了较高的要求[18]。因此能应用于生产中的菌株需满足一定的生理特性要求，为此对获得的菌株开展环境耐受性研究。

以公司桂花曲中产香酵母Y29 为对照菌株，对产酯毕赤酵母Y10 进行了环境耐受性分析。结果显示，随着葡萄糖含量增加，酵母生物量随之降低，Y10 和Y29 菌株最高可耐受500 g/L 的葡萄糖浓度如图1（A）所示。由于发酵过程产生的高浓度乙醇会给酵母细胞代谢带来毒害，使酵母停滞生长或死亡，从图1（B）可知，随着乙醇含量的增加，菌株生长受到抑制，Y10 和Y29 可耐受6 %的乙醇含量，随后随着乙醇含量增加，菌株生物量显著下降。发酵后期酒醅中乙醇浓度不超过6 %，因此Y10酵母能够耐受发酵过程中产生的乙醇浓度。

发酵过程中高浓度的酸类物质会降低酵母细胞的代谢速率，抑制或杀死细胞，从而影响发酵能力。如图1(C)所示，随着pH 值降低，酵母生物量随之降低，但两株菌在pH 值高于3.0 的条件下均能较好生长。酒醅发酵过程pH 值为4 左右，因此Y10酵母能够适应酒醅的酸性环境。

温度是影响酵母生长繁殖的关键因素之一，由图1(D)可知，当温度超过37 ℃，菌株生物量均显著下降，在45 ℃的高温环境下几乎无生长，其中Y29在30 ℃有最高生物量，Y10在37 ℃有最高生物量，表明Y10菌株对高温环境具有较好耐受性。如图1(E)所示，Y29 和Y10 最高可耐受8%的NaCl 浓度，当NaCl 浓度超过8%时，酵母生长受到抑制，菌株生物量急剧下降。

图1 不同条件下酵母菌株生长情况

3 结论

通过产酯显色培养基初筛和液态发酵复筛，从公司清香型白酒菌种库挑选的45 株不同毕赤酵母中获得了5 株产乙酸乙酯较高的毕赤酵母。经实验室固态发酵验证，Y10 菌株具有最高乙酸乙酯含量，为1.21 g/L，相较于对照桂花曲提升57.1%。将Y10 扩大培养制曲应用于清香型白酒中试车间进行酿造，生产原酒中乙酸乙酯含量比对照提升了13.7%。对Y10 耐受性进行分析，该菌株能分别耐受500 g/L葡萄糖、6%乙醇、pH3.0、37 ℃和8%Na-Cl条件，满足清香型小曲白酒的发酵条件。经文献查阅，菌株Y10 为首次在清香型小曲白酒中开展提酯应用研究的费比恩毕赤酵母，能较好地改善原酒品质，具有较高的应用价值，进一步丰富了清香型小曲白酒功能菌资源。