右美托咪定对横纹肌溶解致急性肾损伤肾组织中MyD88和TRAF6蛋白的影响

赵文琪 张 震 夏洪莲 范修颖 张月顺▲

1.牡丹江医学院附属红旗医院麻醉科，黑龙江牡丹江 157000；2.南京明基医院麻醉科，江苏南京 210000

横纹肌溶解症（rhabdomyolysis，RM）本身作为一种临床综合征，是由物理、化学和生物等多种因素的共同作用，导致肌肉细胞破裂，肌红蛋白、电解质和酶类被释放到血液中，造成不同性质和程度的肌肉损伤，随后各种实验室和临床检查异常[1-2]。其最重要的并发症之一是急性肾损伤（acute kidney injury，AKI），病死率高达8%，急性小管坏死和大量炎性细胞浸润是RM诱导的AKI的主要病理特征[3]。研究表明，AKI的发生与TLR/MyD88/NF-κB通路紧密关联[4-5]。但目前关于RM致AKI的具体作用机制尚少，基于此，本研究建立肌内注射甘油致大鼠AKI模型，并测定MyD88和TRAF6在大鼠肾脏组织中的表达。在大鼠肌内注射甘油前，给予右美托咪定（dexmedetomidine，DEX），观察其对AKI的保护作用，以期为RM致AKI的临床预防和治疗提供思路。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

盐酸右美托咪定（佑必妥，扬子江药业集团有限公司，国药准字H20183219，规格：2 ml∶0.2 mg）；髓样细胞分化因子 88（MyD88）和肿瘤坏死因子受体相关因子 6（TRAF6）兔抗鼠多克隆抗体（美国Santa公司）；HRP标记的山羊二抗（北京中杉金桥）；ECL化学发光试剂盒（南京恩晶生物科技有限公司）；ELISA试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）。

1.2 实验动物与分组

SPF级健康雄性SD大鼠共45只，10周龄，体重200～220 g。随机分为CN组、AKI组和DEX组，每组各15只。饲养环境温度保持在22℃～26℃，喂食1周后开始实验。本研究已得到牡丹江医学院实验动物伦理委员会批准（IACUC-20210104-2）。

1.3 动物模型的建立

每组大鼠禁食禁水24 h。除CN组外，其他各组肌内注射50%甘油，剂量为10 ml/kg，建立RM致AKI的大鼠模型。大鼠后腿肿胀僵硬，无法自由活动是成功用药的标志。CN组大鼠在相同部位注射相同剂量的生理盐水。DEX组中，造模前30 min腹腔注射30 μg/kg的DEX，在CN组和AKI组，同期腹腔注射相同剂量的生理盐水。

1.4 取材及标本处理

所有大鼠在造模后24 h选择2%戊巴比妥钠进行麻醉，取下腔静脉血。静置15 min，3000 r/min高速离心，取上清液，冷冻于-20℃的冰箱内。采血后，迅速摘除肾脏。将4%的多聚甲醛溶液注入左肾，固定24 h；右肾储存在-80℃的超低温冰箱里。

1.4.1 血清生化检测 取冻存大鼠血清，使用ELISA试剂盒按试剂说明书检测大鼠血清肌酐（creatinine，Cr）、血 尿 素 氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）浓度水平。

1.4.2 肾组织病理学观察 取冻存肾组织进行石蜡包埋切片。进行HE染色，光学显微镜下（200×）观察各组大鼠肾组织病理学变化。

1.4.3 Western blot法检测肾组织中的MyD88和TRAF6的表达 冻存肾组织提取蛋白进行蛋白定量。对等量的蛋白质进行取样，电泳转移到PVDF膜上，稀释的一抗将其密封，在4°C的摇床中孵化过夜。TBST清洗细胞膜，在与二抗孵化后，TBST再次洗膜，ECL显色发光显影，仪器观察结果并保存图像。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两两比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清BUN、Cr、CK比较

AKI和DEX组BUN、Cr、CK浓度均高于CN组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；DEX组BUN、Cr、CK水平低于AKI组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表1。

表1 各组大鼠血清BUN、Cr、CK比较（x ± s）

2.2 肾脏组织病理学变化

大体观：CN组大鼠双肾表面光滑，形态饱满，呈暗红色，形状类似于蚕豆，弹性良好，色泽正常；AKI组和DEX大鼠双肾体积略有增大，充血水肿，颜色呈紫红色，质脆易出血。DEX组好于AKI组，但与CN组比较双肾肿大，颜色仍较暗。见图1。

图1 各组大鼠肾脏大体观

HE染色显示，CN组大鼠肾脏结构完整。甘油肌内注射后大鼠的病理变化主要发生在肾小管，镜下显示肾小管含有蛋白管型，空泡变性的现象，以及间质的炎性反应。DEX组和AKI组比较，损伤程度有所下降，但是与CN组比较仍然损伤明显。见图2。

图2 各组大鼠肾组织病理学变化（HE，200×）

2.3 各组大鼠肾组织MyD88、TRAF6蛋白水平比较

AKI组和DEX组MyD88、TRAF6蛋白水平高于CN组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；DEX组MyD88、TRAF6蛋白水平低于AKI组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图3。

图3 各组大鼠肾组织MyD88及TRAF6的表达

3 讨论

RM的特征是广泛的骨骼肌纤维破坏及其内容物释放到血液中，通过肾小球滤出并促进AKI的发展，其与RM高病死率和发病率相关[6-7]。其典型三联征包括肌痛、乏力和深色尿[8]。本研究旨在评估DEX对大鼠的甘油诱导的RM致AKI的肾保护功效及可能机制。结果显示肾损伤大鼠血清BUN、Cr显著增加，同时伴随着血清学RM相关生物标志物CK活性的增加，证明甘油注射造模成功。研究证实，Mb/CK比值是RM致AKI的预测因子，Mb/CK比值＞0.2时，RM致AKI的发生风险显著增加[9]。本研究未对血清Mb值进行检测，此为本研究的局限性之一。

RM致AKI的发病机制尚不完全清楚，研究表明炎症反应与RM致AKI的发生和发展有关[10]。TLR信号通路介导的炎症反应是AKI的重要致病因素[11]。在TLR信号通路传导过程中，MyD88及TRAF6参与其中，与细胞内信号传导途径以及其他多种生物过程有关[12-14]。本研究采用Western blot法测定各组大鼠组织中MyD88及TRAF6的表达，发现肌肉甘油注射后其在肾组织表达显著增加，提示MyD88及TRAF6与RM引起的AKI有关。

DEX作为干预药物，其常用于临床麻醉中，是一种对心脏、肾、脑器官的再灌注损伤有保护作用的镇静药[15]。研究表明，DEX能减少炎症因子的产生，从而减少器官缺血再灌注损伤[16]。但其在RM诱导的AKI中的作用及其对TLR/MyD88/TRAF6信号通路的影响尚无报道。Chen等[17]研究的干预方法，在大鼠后腿肌注甘油前，腹腔注射DEX 30μg/kg，显示经DEX干预后，大鼠一般状态较好，相比AKI组肾脏功能明显好转；电镜下观察大鼠肾脏的病理变化，DEX组和AKI组比较，损伤程度有所下降；与AKI模型组比较，MyD88和TRAF6的表达也显著减少，这表明DEX可通过抑制炎症反应减少肾损伤，且可能通过作用于MyD88 和 TRAF6靶点，阻断 TLR 炎症通路。本研究由于条件有限，未对大鼠肾小球滤过率及尿量进行具体监测，为本研究的局限性之二。

综上所述，甘油肌内注射的大鼠肾脏组织中表达了MyD88和TRAF6，提示二者都参与了RM致AKI，炎症反应在损伤中起着重要作用；DEX的干预降低了肾组织中TRAF6和MyD88的表达，表明DEX通过降低TRAF6和MyD88的表达来抑制炎症反应，这可能是DEX减轻RM致AKI的一个重要的保护机制。