基于质谱分析的寻常型银屑病尿液生物标记物检测

李刚刚，马慧群

（西安交通大学第二附属医院，陕西 西安 710004）

银屑病是由免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病，该病治疗困难。其主要的临床表现为局限或者广泛分布的鳞屑性红斑或斑块，病因为遗传、免疫、环境等多种因素[1]。近年来患者数量呈逐渐上升趋势，而其发病机制不清。流行病及基础研究逐渐揭示银屑病不仅仅是一种皮肤病，还是一种可与多种全身性、代谢性疾病并发的重要的系统性疾病[2]。

代谢组是由生物个体系统中所有的代谢物共同组成，其基因表达、表观遗传学、蛋白质活性及环境影响的最终结果。近年来代谢组学被应用于皮肤病研究，由于银屑病有免疫介导的多基因遗传的特点，代谢组学研究在银屑病病因的探索及特异性诊断生物标记物的查找方面提供了重要依据，因此在皮肤科有重要的研究价值[3]。运用代谢组学技术，对患者的临床样本进行银屑病代谢生物标志物探索，逐渐成为银屑病早期诊断、临床分型等方面研究的热点[4]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2016年3—9月，选择在西安交通大学第二附属医院皮肤科门诊及住院的寻常型银屑病患者，其中有家族史的银屑病女性患者7例、无家族史的银屑病患者女性患者7例，以及同期健康体检女性14例。各组间年龄、体质量差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 对照组及银屑病组基本信息对比表

本研究经医院伦理委员会批准通过，纳入者均被告知并签署知情同意书。

1.2 纳入和排除标准 纳入标准：①纳入的患者均符合《中国银屑病治疗指南（2018版）》[1]的寻常型银屑病临床诊断标准，并且处于稳定期，年龄15～63岁；②4周内没有接受抗炎及药物治疗；③进行问卷调查和预实验，分析可能的主要影响因素，并进行分析，保留有意义的病例。排除标准：①处于月经期的患者；②有尿路感染症状，尿常规检查异常的患者；③有妇科炎性反应，分泌物可能污染所留取的标本的患者；④脓疱型、关节病型、红皮病型银屑病及发生在特殊部位银屑病，如指甲、皱褶部位、外阴、黏膜、掌跖等部位的患者；⑤处于妊娠、哺乳期或者计划1年内妊娠者；⑥合并焦虑、抑郁或其他精神疾病者；⑦合并有代谢性或者系统性疾病，未能有效控制者；⑧合并肿瘤者；⑨有水、电解质、酸碱平衡紊乱及严重感染者；⑩内科疾病导致检查结果异常影响判断者；11○已明确对该研究中所用药物过敏者；12○不愿意或者不能配合完成研究者。

1.3 样本收集及处理 本研究采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）及液相色谱-质谱联用（LC-MS）相结合的技术，因此分开叙述。

1.3.1 GC-MS技术

1.3.1.1 样本采集 尿样：所有受试者前1天清淡饮食，于次日清晨空腹采样，留取尿液前先用0.05%呋喃西林溶液对受检者的外阴部进行擦洗，取材过程中用无菌纱布堵住阴道口，用无菌容器收集10 mL中段尿液，所收集的尿液标本3 500 r/min（离心半径为8 cm）离心5 min，取其上清液，置-80℃保存备用。

1.3.1.2 样本处理 尿液样本预处理：取出保存的尿液样本，在室温下自然解冻后取50μL加入到1.5mL离心管中；加入尿素酶（100 U/mL）30 μL，37℃反应15 min；加入混合内标工作液5 μL；然后加入甲醇170 μL，振荡 1 min，充分混匀；常温 12 000 r/min（离心半径为7 cm）离心5 min，取200 μL上清液至1.5 mL安捷伦样品瓶中；抽真空冷冻干燥。

1.3.1.3 样品衍生化 冷冻干燥后的尿液样本通过以下2个步骤对样品进行衍生化反应。首先，往试管中加80 μL浓度为10 mg/mL甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液，在30℃条件下放置90 min进行甲基肟化反应，以保护其羰基。之后，为了增强化合物的挥发性，加入90 μL含有浓度为1%的三甲基氯硅烷的N-甲基三甲基硅三氟乙酰胺溶液（MSTFA+1%TMCS）在37℃环境中静置30 min进行衍生化。

1.3.1.4 GC-MS分析 按照Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL Library Application Note操作。色谱条件为：DB-5柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W Scientific，Folsom，CA）；载气为 He 气体（纯度为99.999%）；进样口温度为260℃；辅助加热区温度为300℃。GC柱温度设定为在60℃下等温加热1 min，然后以10℃/min的炉温升至325℃，在此温度下保持10 min。矫正载气压力至6.51 psi的恒定压力下使肉豆蔻酸（Myristic acid）的保留时间锁定在16.72 min。

质谱条件如下：EI离子源；全扫描模式（50～550 m/z）；电子碰撞电离电压（70 eV）；离子源的温度200℃；采集频率2.91 spec/sec。以不分流模式进样 1.0 μL 样品。

1.3.1.5 数据的预处理及化合物的识别 使用美国MSD Chemstation software E.02.02（安捷伦）录入原始数据，之后将数据导入到美国国家标准技术研究院（NIST）解卷积软件AMDIS中，使用Fiehn保留时间锁定（RTL），数据库对所录入数据进行解卷积处理，并使用 Fiehn GC/MS代谢组学 RTL库（Agilent Technologies，Inc）进行鉴定。导出包含相对峰强度，化合物名称和样品信息的电子表格用于多变量数据分析。

1.3.1.6 模式识别和统计学分析 将预处理的数据导入 MATLAB2009a（Math Works Inc.，Natick，MA，USA）用于多变量统计分析。首先进行主成分分析（PCA）以进行代谢轮廓辨别。然后使用非参数Mann-Whitney-Wilcoxon检验确定组间的改变的代谢物。原始P值经Benjamini&Hochberg（BH method）方法校正，采用错误发现率（FDR）控制多重检验下的假阳性结果。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.3.1.7 功能富集和通路拓扑分析 对差异性代谢 物 使 用 网 络 Metabo Analyst 3.0（http：//www.metaboanalyst.ca/）工具进行通路分析，以挖掘潜在的生物信息。首先使用ORA算法（Over-representation analysis）进行功能富集分析，再通过计算相对介数中心度进行通路拓扑分析。

1.3.2 LC-MS技术

1.3.2.1 收集样本 所有的受试者在前一日须清淡饮食，在次日晨空腹留取生物学标本，取尿样本前使用0.05%的呋喃西林溶液对受检者的外阴部位进行擦洗，取材过程中用无菌纱布堵住阴道口，用无菌的容器收集10 mL中段尿液，所收集的尿液标本3 500 r/min（离心半径为14 cm）离心5 min，取其上清液置-80℃冰冻保存备用。

1.3.2.2 处理样本 取出冰冻的样本，常温下溶解。先从实验组和对照组样本中分别取出50 μL混匀，配成质控组（Quality Control，QC）样本。从实验组、对照组和指控组分别取出100 μL，分别加入乙腈500 μL，并涡旋混匀，4 ℃条件下、14 000 r/min（离心半径为7 cm）5 min，取上清液进行LC-MS分析。

1.3.2.3 检测样本 色谱的条件：使用B Sciex TripleTOF 5600质谱仪和Agilent快速分离液相色谱系统。色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，Agilent）。色谱柱温度：40℃。样本进样量：2 μL。

正离子的组成：流动相为0.1%甲酸和水；流动相B为0.1%甲酸和乙腈。负离子的组成：流动相A成分是水；流动相B的成分是乙腈，实验开始前为了避免气体对实验结果造成影响，将流动相放进数控超声波清洗器中进行排气处理。

质谱的条件：氮气是用于锥孔、雾化的气体；ESI是离子源：分别使用正、负离子不同模式进行检测（ESI+/ESI-）；飞行管检测的模式为V型；毛细管的电压是3.2 kv；萃取锥孔电压是3 v；锥孔电压是35v；离子源温度为100℃；脱溶剂气流量是650L/h；脱溶剂气温度是350℃；反向锥孔气流量为50 L/h；低质量区分辨率是4.7 v；高质量区分辨率是15 v；离子能量是0；碰撞池入口电压为2 v；碰撞池出口的电压为-10 v；碰撞的能量是4 eV；碰撞气流是0.5 mL/min；检测器为 1 800 v；扫描时长为 1 s；扫描的间隔时间是0.02 s；敏感度选择normal；动态范围选择extended；质核比的范围选择50～1 000 m/z；对样品进行仪器分析之前，先使用质谱较机液对其质量轴进行校正。

1.3.2.4 数据的处理 原始数据由HPLC-TOFMS获得，运用Analyst1.5.1软件包中的Data Acquisition软件进行数据采集，得到格式为.scan的文件，分别为：样本名称和各化合物保留的时间、精确质核比、峰度的值等相关信息。银屑病患者及正常人血样的LC-MS总离子流图通过软件包中PeakView软件获得。

数据的预处理：使用MaekerView软件，将所得的.scan文件数据进行归一化、标度化、滤噪及色谱峰对齐等一系列的处理。

1.3.2.5 统计学分析 运用聚类分析、PCA、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、t检验等统计学方法对实验数据进行分析，检验银屑病组患者与健康对照组间的代谢差异。

①为了对数据进行降维压缩，用主要成分描述数据的内部特征，使用MaekerView软件对得到的数据进行主成分分析。各主成分相互间呈正交，并且第一个主成分能包含数据的绝大部分信息，第二个主成分次之，以此类推。代谢信息相近样本在PCA得分图（Score plot）中聚集在相同的区域，相距越远则样本的代谢差异就越大。②对照组和银屑病组数据的t检验使用MaekerView软件进行，选取差异有显著统计学意义（P＜0.05）的变量。③使用BRB软件对于P＜0.05的数据进行聚类分析，以评价样本间的相似性。④PLS-DA使用SIMCA-P11.5软件对P＜0.05的数据进行处理，用来考察这些差异变量对银屑病组及对照组的判别能力，从而获得代谢的差异[权重值（VIP）＞1]。⑤利用SPSS 20软件绘制受试者操作特征曲线（ROC）的方法，结合绘制均值柱形图来选定银屑病患者尿液中潜在的生物靶标物。

2 结果

有、无家族史的女性寻常型银屑病患者尿液中L-丙氨酸、天门冬氨酸水平高于健康对照组，但甘油（丙三醇）水平则低于健康对照组，见图1、2。

图1 无家族史的女性寻常型银屑病患者尿液中L-丙氨酸、天门冬氨酸水平高于对照组，甘油水平则低于对照组

图2 有家族史的女性寻常型银屑病患者尿液中L-丙氨酸、天门冬氨酸水平高于对照组，甘油水平则低于对照组

3 讨论

银屑病是遗传与环境相关性疾病，机体代谢改变引起的表观遗传学异常似乎影响广泛。表观遗传学研究也发现，代谢过程中通过DNA甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化、组蛋白修饰导致的染色质重塑，通过 p53 途径中的 p14ARF、MDM2、p21WAF1、Bcl-2/Bax、原癌基因（c-Myc）等效应分子以及缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）影响其介导的细胞周期阻滞，导致细胞凋亡或过度增殖，参与了银屑病的发病[5]。银屑病患者存在着明显的代谢异常，包括氨基酸代谢紊乱和糖酵解活性增高等，其免疫介导的炎性反应过程与动脉粥样硬化类似[6-7]，由此也许是某些环境因素诱发了机体代谢过程的改变，活化了T细胞，启动了机体的固有免疫和适应性免疫，导致了银屑病的启动和持续。

现代生物学技术为快速系统的研究银屑病代谢提供了可能：代谢组学的分析技术主要有核磁共振（NMR）和质谱（Mass spectrum，MS）。MS有极高的检测敏感度和目标特异性，可对样品中多种代谢成分同时进行检测与鉴定。色谱-质谱联用技术主要分为GC-MS和LC-MS 2大类，GC-MS技术有优秀的敏感度及良好的分辨率，可通过比对结构信息对代谢组分进行定性，同时有商业性的化合物谱库，可提高鉴定结果的统一性及重现性，但无法检测样品中挥发性、热稳定性较差的代谢物，对于体系中极性比较大的难挥发组分，需要进行繁琐的衍生化预处理，影响结果信息的准确性。LC-MS技术对待测组分的挥发性和热稳定性没有要求，无需对样本进行衍生化操作，样品前处理简单，分离物质快速、高效。但LC-MS缺少可以参考的标准谱图数据库，只能通过所获得代谢物的精确相对分子质量与数据库进行对比，以验证确定分子的结构信息，同时还存在基质效应、共流出峰间离子抑制及诱导作用等问题。基此，本研究采用GC-MS和LC-MS联合技术，从有家族聚集倾向的银屑病患者入手，以家族内外健康人和银屑病散发病例为对照，将可能的靶标物追踪进行分析。

通过银屑病代谢异常生物标记物的文献追踪和Meta分析，结果显示乳酸、尿酸、丙氨酸、丙三醇、天门冬酰胺、天门冬氨酸等与银屑病代谢关系密切，研究已经在系统性评价的国际化前瞻性注册数据库（PROSPERO）注册（注册号：CRD42017057297），分析结果的森林图见图3。本文的质谱分析中提示女性寻常型银屑病患者L-丙氨酸、天门冬氨酸较健康组高，甘油水平较健康组低，且无家族聚集现象的病例也有同样表现。Kang等[8]研究也发现与健康组相比，银屑病患者血清中天门冬氨酸水平升高。寻常型银屑病患者糖代谢紊乱，会分解甘油进行糖异生，这也许是尿中甘油水平降低的原因。有研究指出血中天门冬氨酸、丙氨酸含量明显增高可能与肝脏代谢功能异常有关[9]。这可能是尿中上述成分异常的原因。

图3 银屑病代谢异常生物标记物的文献追踪和Meta分析森林图

本研究期望通过对银屑病患者生物学样本中代谢异常物质的查找，以求深入研究银屑病的发病机制，同时为开发新的治疗靶点及预防银屑病的发生、评估银屑病的预后提供新的思路。