薄荷中黄酮类化合物萃取工艺优化及成分分析

张晴晴， 邢何欢， 龙昌辉， 刘 转

(1.亳州学院中药学院，安徽 亳州 236800；2.安徽天凯生物科技有限公司，安徽 滁州 239500)

薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)为唇形科薄荷属的一种具有经济价值的芳香植物[1-2]。薄荷中的化学成分主要有挥发油类、有机酸类、萜类、黄酮类等，其中，黄酮类物质具有较强的抗衰老、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗炎等作用[3-5]。薄荷黄酮显著的生理活性引起了人们的关注，而人体不能直接合成黄酮类化合物，只能通过食物、药品获得。因此，如何从薄荷中提取具有生理活性的薄荷黄酮成为研究和开发利用的热点[6-8]。

目前薄荷中黄酮类化合物的提取工艺主要采用有机溶剂提取法、微波萃取法、超临界CO2萃取技术和超声波提取法[9-13]。其中，超临界CO2流体萃取技术是近年来发展的一种新型提取分离的技术方法，该法具有无溶剂残留、萃取能力强、提取效率高、活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏、安全廉价等优点，此法符合当今人们倡导绿色、环保理念，成为近年来研究的热点，该技术已在黄酮类成分的提取中得到广泛应用[14-20]。丁丽娜等[19]采用超临界CO2萃取法从沙棘果油中提取18种黄酮类化合物，表明该技术具有低温提取、无有毒残溶和可以选择性分离的特点。Lingzhao等[20]用超临界CO2萃取技术从野葛中萃取出黄酮类化合物，并对试验进行了优化。采用超临界CO2萃取技术萃取薄荷黄酮鲜少报道，因此，该研究采用超临界CO2萃取技术萃取薄荷中的黄酮类化合物，利用正交试验确定其最佳萃取工艺，采用高效液相色谱法(HPLC)对薄荷中的黄酮类化合物进行成分分析。该研究旨在获取薄荷黄酮较高提取率的同时，减少萃取过程对环境的污染，从而为薄荷资源的深度开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

薄荷的干燥地上部分(亳州康美中药材大市场)。

1.2 试剂与仪器

HA0-50-06型超临界萃取装置(江苏华安超临界萃取有限公司)；LC-20型高效液相色谱仪(岛津仪器苏州有限公司)；UV4150紫外可见分光光谱仪(岛津仪器苏州有限公司)；DFY-400摇摆式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；聚酰胺薄膜10×10 cm(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂出品) ；电子天平(型号：HZK-FA210华志电子科技有限公司)；高速台式离心机(型号H1750 湖南望城经济开发区金穗路35号)；乙腈、无水乙醇、甲醇、正丁醇、乙酸等试剂均为分析醇。

1.3 方法

1) 芦丁标准曲线的绘制 称量芦丁标准品5.2 mg,放入25 mL容量瓶中，用浓度70%的乙醇定容,摇匀,放入冰箱冷却,待用。用移液枪准确吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL上述芦丁标准溶液分别置于25 mL比色管中,加入浓度为70%的乙醇至10.0mL,再加入1 mL浓度为5%的NaNO2,摇匀,搁置6 min后，放入1 mL浓度为10%Al(NO3)3·9H2O,摇匀,搁置6 min,再取10 mL浓度为4%NaOH,用纯化水定容,摇匀,搁置15 min。依次加入到比色皿中，放入紫外分光光谱仪中，在波长510 nm处测定吸光度值A。

2) 薄荷中黄酮类化合物的提取方法 将薄荷全草进行粉碎，准确称取薄荷粉末200 g装入萃取釜中，设置萃取温度和分离温度，当萃取和分离温度均达到设定温度，制冷温度在5 ℃以下，打开堵头装料，调节阀门使萃取压力和储罐压力相等。开启CO2泵，CO2由压缩机压缩进入萃取釜，达到设定压力且稳定后，加入一定浓度的夹带剂(乙醇)进行超临界萃取，每间隔30 min从出口处收集萃取原液，直至萃取原液收集完全。将上述萃取原液用N-1300旋转蒸发仪减压浓缩，直到体积不在发生变化时。将所得浓缩液用石油醚萃取除去脂溶性杂质,收集上清液,并旋蒸蒸干,用三氯甲烷溶解,再加70%乙醇分层,取下清液,得薄荷黄酮萃取液。

将上述黄酮萃取液移取1 mL于25 mL比色管中,按照1)中所述的方法进行配制,测定吸光度，计算样品浓度,根据下列公式计算薄荷样品中黄酮提取率：

(1)

式中，C：黄酮萃取液浓度，mg/mL；V：萃取液体积，mL；N：稀释倍数；M：薄荷粉末质量，g。

3) 单因素实验 采用单因素试验，研究夹带剂浓度、萃取压力、萃取温度、萃取时间的变化对薄荷中黄酮类化合物提取率的影响[21]。考察4方面的因素，每个因素考察5个水平，每个水平试验3次，取其平均值，计算每个水平的标准误差。具体参数设置详见表1。

表1 单因素实验因素水平表

4) 正交试验 根据单因素实验结果，以夹带剂浓度A、萃取压力B、萃取温度C、萃取时间D为考察因素，每个因素选择3个水平，采用L9(34)正交表进行正交试验，因素水平表如表2所示，以提取率为评价标准，确定最佳提取工艺条件[22-25]。

表2 正交因素水平表L9(34)

5) HPLC分析黄酮类化合物 采用Compass C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈(A)-3%冰醋酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～20 min，15%～33%A，20～35 min,33%～40% A)，流速为 0.5 mL/min，波长检测为284 nm，柱温为35 ℃；进样量为10 μL[26-28]。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

以标准品浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，得方程A=13.295C-0.002 8(R2=0.999 9)。该方程将用以测定薄荷提取液中的薄荷黄酮提取率(图1)。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素试验结果

1) 夹带剂浓度的选择 黄酮类化合物的极性较大，因此采用CO2作为超临界流体进行萃取时需要加入夹带剂。薄荷黄酮类物质，易溶于热水且极性也较大，所以采用极性大的乙醇作为夹带剂较好[18]。在萃取温度为55 ℃、萃取压力为25 MPa、萃取时间为90 min时，选择夹带剂浓度50%、60%、70%、80%和90%乙醇，考察不同夹带剂浓度对薄荷黄酮提取率的影响(图2)。

图2 夹带剂浓度对提取率的影响

由图2可知，薄荷黄酮提取率随夹带剂浓度的升高呈现下降-升高-下降-升高的趋势，当乙醇浓度为70%时，提取率最大。这是由于某些醇溶性杂质等成分与黄酮类化合物竞争同水分子的结合，从而导致提取率下降，因此，乙醇浓度应选择70%为宜。

2) 萃取压力的选择 在萃取温度55 ℃、萃取时间90 min，夹带剂70%乙醇，考察萃取压力为10、15、20、25和30 MPa时，对薄荷黄酮提取率的影响(图3)。

图3 萃取压力对提取率的影响

由图3可知，萃取压力为10～20 MPa时，提取率随压力增大而缓慢降低，而后随压力增大提取率逐渐增大，当压力达到25 MPa时，提取率达到最大，而后提取率随压力增大而减小，这可能是由于当压力达到一定值后随着压力的增大使部分薄荷原料凝结成块导致提取率的下降，因此，萃取压力选择25 MPa为宜。

3) 萃取温度的选择 在萃取压力25 MPa，萃取时间90 min，夹带剂70%乙醇，考察萃取温度为45、50、55、60和65 ℃时，对薄荷黄酮提取率的影响(图4)。

图4 萃取温度对提取率的影响

由图4可知，在55 ℃以下，薄荷黄酮提取率随温度的增加而提高，当温度高于55 ℃后，呈现下降趋势。这是由于随着温度升高，分子运动速度加快，促使溶解速度提高，有利于提取，但是当温度升高到一定值后，超临界流体的密度减小，从而导致流体的溶解能力降低，甚至会破坏某些化学成分，同时杂质含量也会增加，从而导致提取率降低，这也为后续的纯化带来困难[18]。因此，萃取温度选择55 ℃为宜。

4) 萃取时间的选择 在萃取温度55 ℃、萃取压力25 MPa，夹带剂70%乙醇，考察萃取时间为0、60、90、120和150 min时，对薄荷黄酮提取率的影响见图5。

图5 萃取时间对提取率的影响

由图5可知，在30～90 min时，提取率随萃取时间增加而逐渐增大，增加趋势明显，在萃取时间为90 min时，提取率最大，为5.394%。而后随时间的延长，提取率下降，这可能是提取时间过长，杂质成分的提取率也在增加，杂质过高使萃取粘液度增大，从而导致薄荷黄酮的提取率降低[13]。因此，萃取时间选择90 min为宜。

2.3 正交试验结果

根据各单因素试验结果，根据表2进行正交试验，结果见表3。结果表明，影响薄荷黄酮提取的各因素影响大小顺序为：A(夹带剂浓度)>D(萃取时间)>C(萃取温度)>B(萃取压力)。且最佳提取工艺条件为：A3B2C2D3，即夹带剂的浓度80%，萃取压力25 MPa，萃取温度 55 ℃，萃取时间120 min。采用上述提取条件进行超临界CO2萃取操作，所得提取率为5.172 %。

表3 正交试验结果

续表3 正交实验结果

2.4 HPLC分析黄酮类化合物结果

按照1.2中所述的方法利用HPLC对最佳条件下萃取的薄荷黄酮类化合物进行定性分析[29-30]，混合对照品及样品高效液相色谱图(图6)。图6-A是3种混合对照品的HPLC图，3种混合对照品的保留时间分别是芦丁18.5 min、橙皮苷24.5 min、蒙花苷31.5 min。图6-B是样品溶液的HPLC图，图中3个主要峰分别是芦丁、橙皮苷和蒙花苷，其保留时间分别是19.5、24.0、31.0 min，这与对照品结果基本一致，图中还存在一些小的峰型，这可能是在分离纯化提取液时未能将提取液中的杂质充分的分离开。

图6 黄酮标准品和薄荷黄酮提取物样品的HPLC图

3 讨论与结论

近年来，黄酮类化合物的提取工艺主要有醇提法、机溶剂提取法和超声波辅助提取法等，但普遍存在提取时间长，提取率低，对环境不友好等弊端。超临界CO2萃取技术作为一种新兴的提取技术，具有无溶剂残留、萃取能力强、提取效率高、活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏、安全廉价等优点。

该文采用超临界CO2萃取技术萃取薄荷中黄酮类化合物，以提取率为评价指标，通过单因素试验和正交试验设计，得到最佳萃取工艺条件：乙醇浓度80%、萃取压力25 MPa、萃取温度55 ℃、萃取时间120 min。在该工艺条件下薄荷黄酮的提取率为5.17%，明显高于已报道的提取率[10]。

采用高效液相色谱法(HPLC)对薄荷中黄酮类化合物进行成分分析。结果表明:薄荷中有3种黄酮类化合物，分别是橙皮苷、蒙花苷和芦丁。

该研究旨在获取薄荷黄酮较高提取率的同时，减少萃取过程对环境的污染，从而为薄荷资源的深度开发应用提供理论依据。