CENPW基因在肾透明细胞癌中的表达特征及预后评估价值

田 捷，陈吉涛，邱 美，杨举良，刘 飞

(南昌大学第二附属医院泌尿外科，南昌 330006)

肾细胞癌(RCC)是起源于肾实质的恶性肿瘤，发病率在泌尿系统肿瘤中排第3位[1]。肾细胞癌的病理分型中以肾透明细胞癌(KIRC)、肾乳头状癌(KIRP)和肾嫌色细胞癌(KICH)较为常见，其中KIRC是肾细胞癌最常见的亚型，约占75%～80%[2]。目前外科手术仍是治疗肾细胞癌的主要手段，但是术后复发率高达30%，此外大约有三分之一的肾细胞癌患者确诊时已经发生了局部或远处转移，失去了手术根治的机会，其次晚期或转移性肾细胞癌对放疗化疗不敏感，有效率低[3]。因此，为了改善KIRC患者的生存预后，寻找合适的筛查或监测的分子标记物迫在眉睫。着丝粒蛋白W(CENPW),又称癌症中上调基因2(CUG2)，是一种核蛋白，参与细胞的有丝分裂、细胞周期、细胞增殖等，在大多数人体肿瘤组织中高表达，如肺癌、肝癌、卵巢癌和脑胶质瘤等，一致被认为是癌基因[4-7]。因此，本研究通过TCGA数据库，分析CENPW基因在KIRC中的表达特征及预后价值，以便为KIRC的诊断治疗寻找有效的分子标记物。

1 资料与方法

1.1 资料收集

从TCGA数据库(https://www.tcga.org/)中下载KIRC的mRNA数据和相关的KIRC患者肿瘤组织样本541例，正常组织样本72例作为对照。运用R3.6.3软件提取CENPW基因在KIRC组织和正常肾组织的表达情况,通过Wilcoxon rank sum检验分析比较二者中CENPW的表达；采用Wilcoxon signed rank检验对72对KIRC组织和正常肾组织中CENPW表达进行配对差异分析。分别获取KIRC患者的临床资料，主要有年龄、性别、生存时间、生存状态、肿瘤分级、临床分期及TNM分期。

1.2 研究方法

1.2.1 分析CENPW在KIRC组织中的表达差异与临床病理参数的关系

根据CPNEW在KIRC的表达中位值，将KIRC患者分为高、低表达组。运用R 3.6.3软件，通过Kruskal-Wallis检验和Wilcoxon rank sum检验分析CENPW表达与KIRC患者临床病理参数的关系，包括肿瘤分级、临床分期、T分期、N分期、M分期；采用Kaplan-Meier生存分析CPNEW高、低表达组的总体生存率(OS)；采用单、多因素COX回归分析CPNEW基因与患者预后的相关性，并分析CENPW基因在KIRC中的预后价值。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测CENPW基因mRNA在KIRC细胞系和正常肾上皮细胞系中的表达

通过体外培养正常肾小管上皮细胞系HK2和KIRC细胞系786-O、ACHN、ORSC-2、A498,用细胞或组织RNA提取试剂trizol(全世金生物公司)提取各个细胞系的总RNA,EasyScript©First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(全世金生物公司)将其逆转录为cDNA,TaKaRa Ex Premier DNA Polymerase(TAKARA生物公司)进行扩增，采用2-ΔΔCT方法进行计算验证。CENPW基因上引物：3′-GGAGCTTGTGTGCGATACAGAGAG-5′；下引物：3′-GCCTTCCGCTTTATCTGCTTCCTC-5′。GAPDH基因上引物：3′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-5′；下引物：3′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5′。引物均由生工生物公司合成生产。

1.2.3 统计学方法

使用R3.6.3软件进行数据处理。使用Wilcoxon rank sum检验和Wilcoxon signed rank检验分析CENPW基因在KIRC正常组织和肿瘤组织的表达；通过Kruskal-Wallis检验和Wilcoxon rank sum检验分析CENPW表达与KIRC患者临床病理参数的关系；使用Kaplan-Meier方法进行生存分析；使用单因素COX回归分析OS与临床相关因素之间的关系；采用多因素COX回归分析，筛选KIRC的独立预后因素。用配对t检验比较CENPW基因在KIRC肿瘤细胞系和正常细胞系中的表达差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CENPW在KIRC组织和细胞系中的表达

与正常肾组织、癌旁组织相比，CENPW在KIRC组织中的表达水平均显著增加(P<0.001，图1)。RT-qPCR结果显示，与正常肾小管上皮细胞(HK2)相比，CENPW mRNA在KIRC细胞系(786-O、ACHN、ORSC-2、A498)4种细胞均高表达，差异均具有统计学意义(P<0.05，图2)。

2.2 CENPW的表达与KIRC患者临床病理参数的关系

Kruskal-Wallis检验和Wilcoxon rank sum检验分析显示，CENPW在KIRC患者中的表达与肿瘤分级、临床分期、病理T分期、病理N分期、病理M分期均显著相关(P<0.001)。见图3。

A:CENPW基因在正常肾组织和KIRC组织中的表达；B:CENPW基因在KIRC组织、配对癌旁组织中的表达；***P<0.001。图1 CENPW基因在KIRC组织中的表达

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。图2 CENPW mRNA在KIRC细胞系中的表达

A:肿瘤分级；B：临床分期；C:病理T分期；D:病理N分期；E:病理M分期；***P<0.001。图3 CENPW表达与KIRC患者临床病理参数的关系

2.3 CENPW的表达与KIRC患者OS、临床预后的关系

Kaplan-Meier生存分析结果显示，CENPW在KIRC组织高表达组中的OS明显低于低表达组，差异具有统计学意义(P<0.001)，见图4。单因素COX回归分析结果显示，CENPW在KIRC组织中的表达、年龄、肿瘤分级(grade)、临床分期(stage)、TNM分期与患者的生存均显著相关(均P<0.001)；多因素COX回归分析结果显示，CENPW基因在KIRC组织中的表达可以作为KIRC预后的独立危险因素。见表1。

t/个月图4 CENPW表达与KIRC患者OS的关系

表1 单因素和多因素COX回归分析

3 讨论

由于隐匿的早期症状和缺乏有效的早期诊断方法，大多数新诊断的KIRC患者已经处于晚期，通常伴有局部或远处转移，导致预后不良[8]。目前，KIRC暂时还没有找到具有敏感性和特异性的分子标志物，这表明了确定分子标志物对于KIRC早期筛查和监测术后复发的重要性[9]。有研究[10-11]表明，癌基因激活和抑癌基因失活是KIRC发病机制中的重要原因。因此，迫切需要寻找有效的预后分子标志物和癌症相关的分子机制，以挖掘KIRC的治疗靶点。CENPW是着丝粒蛋白复合物成员之一，其在多种人类癌症类型中差异表达，通常在各种肿瘤组织(如胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌)中高表达，并且在肿瘤发生中起关键作用[4-7]。CENPW基因被定位到染色体6q22.32，其跨度约8.5 kb，带有3个外显子结构，编码88个氨基酸的多肽[12]。有研究[13]揭示CENPW为细胞分裂、细胞周期、细胞增殖过程所必需，且位于核仁或者着丝粒上，能和着丝粒蛋白T相互结合,共同参与着丝粒染色质结构的形成。KAOWINN等[14-17]研究发现，由CENPW诱导的EGFR表达增加，通过Stat1-HDAC4信号传导赋予阿霉素耐药性[14]；CENPW基因敲除通过使E2F信号失活抑制肝细胞癌的进展[15],CENPW通过TGF-β信号转导诱导人肺癌细胞上皮-间质转化,CENPW可以发挥促癌作用[16]，着丝粒蛋白W具有调控人脑胶质瘤侵袭性的作用[17]。

分析TCGA数据发现，CENPW基因在KIRC组织中显著高表达；同时发现CENPW基因的mRNA表达水平在肾癌细胞系均显著高于正常肾小管上皮细胞系。此外，CENPW的表达与KIRC患者的肿瘤分级、临床分期和TNM分期显著相关，提示CENPW参与KIRC的肿瘤生长；CENPW的表达与KIRC患者的总体生存率呈负相关，单、多因素COX回归分析表明CENPW是KIRC的独立危险因素，提示CENPW与患者的预后有关。

总之，与正常肾组织相比，CENPW高表达在KIRC组织中更常见，高表达的CENPW可以作为患者不良预后的分子标志物。本次研究是根据生物信息学结果在体外细胞系mRNA水平验证CENPW的表达差异,缺少在动物水平和人体组织水平证实本次实验研究的结论，同时需要进一步挖掘CENPW在KIRC发挥的功能以及与CENPW相关的信号通路，以明确其具体作用分子机制。