胍基化壳聚糖季铵盐的制备及其抗菌性能

王林，辛梅华，李明春，雷嘉华

(华侨大学 材料科学与工程学院，福建 厦门 361021)

聚六亚甲基双胍(PHMB)由于水溶性高、化学性质稳定、抗菌活性优异和毒性低等优点，在胍盐中占有突出的地位[1].PHMB在生理pH值下具有高的正电荷，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和白色念珠菌都有疗效，用PHMB处理伤口还有利于伤口愈合[2].目前，PHMB常用于添加到水凝胶中，赋予水凝胶抗菌性能[3-5]，以制备抗菌涂层[1，6-7].PHMB在水中具有良好的溶解性能，附着在材料表面的耐久性差，为解决这一问题，Song等[8]首先合成丙烯酸-PHMB，通过碳碳双键和羟基的加聚反应接枝到纤维素上，制备的纤维素膜对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)具有良好的抑制作用.

天然高分子壳聚糖具有良好的生物相容性、可降解性和广谱抗菌性[9]，但是，壳聚糖的溶解性限制了其应用.壳聚糖季铵化改性不仅可以提高壳聚糖的溶解性能，还可以提升壳聚糖的抗菌性能，扩展壳聚糖的应用[10].Oyervides-Muoz等[11]将制备的苯扎溴铵、溴化吡啶和溴化三乙基铵分别与壳聚糖进行接枝反应得到3种不同的壳聚糖季铵盐，抗菌结果表明，壳聚糖季铵盐的抗菌性能显著提高.Wang等[12]在壳聚糖季铵盐(HACC)缓冲液中添加PHMB制备复合抗菌剂，抗菌实验和细胞毒性结果表明，复合抗菌剂的抗菌效果和生物安全性均优于单一的HACC或PHMB.Abri等[13]通过肝素和壳聚糖之间的离子相互作用制备载PHMB的纳米粒子，PHMB的持续可控释放超过10 d，制备的载药纳米粒子可以直接杀死革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌.Xu等[14]将壳聚糖和PHMB固定在聚丙烯腈纳米纤维上，得到具有耐洗性和持久抗菌活性的纳米纤维.

为提高季铵化壳聚糖的抗菌性能，本文将聚六亚甲基双胍接枝到N-(2-羟丙基-3-甲基氯化铵)壳聚糖(HTCC)上，制备胍基壳聚糖季铵盐(HCP)，并测定产物的最低抑菌质量浓度和抑菌率.

1 实验部分

1.1 主要试剂及仪器

壳聚糖(CS，分子质量为50 ku，脱乙酰度为89%)，山东省青岛市海汇生物工程有限公司；2，3-环氧丙基-3-甲基氯化铵(ETA)，山东省东营市国丰精细化工有限公司；聚六亚甲基双胍(PHMB)，北京市桑普生物化学技术有限公司；三聚氯氰(TCT)、N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，上海市安耐吉化学技术有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、三乙胺(TEA)，上海市国药集团化学试剂有限公司；1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、琼脂、蛋白胨、酵母浸粉，上海市阿拉丁生化科技有限公司.其他试剂为市售分析纯.

IS50型傅里叶变换红外光谱仪，美国Nicolet公司；AVANCE Ⅲ 500 MHz型核磁共振波谱仪，德国Bruker公司；Vario MICRO cube型元素分析仪，德国Elementar公司；FD-1B-50型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司.

1.2 胍基壳聚糖季铵盐的制备

1.2.1 壳聚糖季铵盐的制备 将25.0 g ETA溶解在20 mL水中得ETA溶液，5.0 g壳聚糖溶解在200 mL体积分数为2%的醋酸水溶液中，将ETA溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，升温至70 ℃，恒温反应8 h，蒸馏水透析，冷冻干燥得N-(2-羟丙基-3-甲基氯化铵)壳聚糖(HTCC).

1.2.2 壳聚糖季铵盐接枝聚六亚甲基双胍的制备 采用正交实验法对壳聚糖季铵盐接枝聚六亚甲基双胍的反应条件进行优化，接枝反应的正交因素水平，如表1所示.表1中:t1，t2分别为第一、第二阶段反应时间；n(HTCC)∶n(TCT)为HTCC和TCT的物质的量之比；m(HTCC)∶m(PHMB)为HTCC和PHMB的质量比；θ为第二阶段反应温度.

表1 正交因素水平表Tab.1 Table of orthogonal factor level

取5 mL DMF置于烧瓶中，0～5 ℃下加入0.36 g TCT，完全溶解后，滴加0.76 g PHMB溶液，用缚酸剂调节反应的pH值使之维持在中性，恒温反应8 h，得溶液1.称取0.24 g HTCC溶解在30 mL水中，将溶液1加入HTCC溶液中，调节pH值使之维持在中性，40 ℃反应14 h，透析后冷冻干燥得到胍基壳聚糖季铵盐(HCP).HCP的制备路线，如图1所示.

图1 HCP的制备路线Fig.1 Preparation route of HCP

1.3 元素分析(EA)

壳聚糖及其改性产物在80 ℃真空干燥至恒质量，采用Vario MICRO cube型元素分析仪进行测定.壳聚糖的脱乙酰度(DD)和壳聚糖季铵盐的季铵化取代度(DS)通过C的质量分数w(C)和N的质量分数w(N)之比计算.由于PHMB是聚合物，胍基壳聚糖季铵盐的胍基化取代度无法通过w(C)/w(N)计算得出，因此，用N的质量分数的变化表示[15].

1.4 傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析

采用溴化钾压片法，在IS50型傅里叶变换红外光谱仪上测定壳聚糖及其改性产物的红外光谱，扫描范围为4 000～500 cm-1，扫描32次.

1.5 核磁共振氢谱(1H NMR)分析

PHMB、壳聚糖季铵盐和胍基壳聚糖季铵盐溶解在D2O中，用AVANCE Ⅲ 500 MHz型核磁共振波谱仪测定产物的1H NMR，测定温度为22 ℃，采样64次，弛豫时间为2 s.

1.6 抗菌性能测试

1.6.1 培养基的配制 LB液体培养基的配制[10]：取1.0 g胰蛋白胨，0.5 g酵母浸粉，1.0 g氯化钠至锥形瓶中，加入100 mL去离子水溶解，用浓度为0.1 mol·L-1的NaOH溶液调节pH值至7.0，固体培养基另加入2.0 g琼脂，高温灭菌后使用.

1.6.2 最低抑菌质量浓度和最低杀菌质量浓度 冷冻保存的菌液先在37 ℃摇床中培养18～24 h，再用梯度稀释法稀释菌液备用.将样品溶解在无菌水中，配制质量浓度为5.0 mg·mL-1的样品溶液，倍半稀释后，各取100 μL依次加入96孔板中，然后在各孔中加入100 μL稀释后的菌液.将96孔板放置在37 ℃培养18 h，观察浊度，取无明显浊度变化对应的质量浓度记为该样品的最低抑菌质量浓度(ρMI)，设置3组平行实验.取大于最低抑菌质量浓度的孔板中的混合液100 μL涂覆在琼脂板培养基上，37 ℃培养18 h，琼脂板上菌落数小于或等于5个对应的质量浓度记为最低杀菌质量浓度(ρMB).

1.6.3 抑菌率测定 无菌水配制样品溶液，样品质量浓度分别为5.0，2.0，1.0 mg·mL-1.取等体积的样品溶液和稀释后的菌液混匀后置于摇床中动态培养30 min，取100 μL混合液均匀涂覆在琼脂板上，以无菌水为对照组，37 ℃培养18～24 h，读取各培养皿上细菌的菌落数，根据菌落数计算抑菌率，重复3次取平均值.抑菌率的计算公式为

2 实验结果与讨论

2.1 不同反应条件对聚六亚甲基双胍取代度的影响

由于PHMB聚合物中N的质量分数较高，将PHMB接枝到HTCC上得到的产物中N的质量分数也随之增加.采用正交实验，以产物中N的质量分数为指标，通过各水平对应的N的质量分数的平均值间接选择最佳反应条件，最后综合考虑取代度和生产成本得出最佳的反应条件[16].不同反应条件下制备的胍基壳聚糖季铵盐的实验结果，如表2所示.

表2 不同反应条件下制备的HCP的实验结果Tab.2 Experimental results of HCP prepared under different reaction conditions

不同反应条件对HCP取代度的影响，如图2所示.由图2(a)可知:三聚氯氰和PHMB发生一取代的取代度随着反应时间的延长而增大；前4 h，随着反应时间的延长，反应速率增加较快，4 h后反应速率增加缓慢.这是因为初始溶液中单体质量浓度较高，分子之间发生碰撞的几率较大；随着反应时间的延长，溶液中单体逐渐被消耗，反应速率逐渐降低.因此，选择第一阶段反应时间为8 h.

(a) 第一阶段反应时间 (b) n(HTCC)∶n(TCT)

(c) m(HTCC)∶m(PHMB) (d) 缚酸剂

(e) 第二阶段反应时间 (f) 第二阶段反应温度图2 不同反应条件对HCP取代度的影响Fig.2 Effect of different reaction conditions on substitution degree of HCP

由图2(b)可知:HTCC和TCT的最佳物质的量之比为1.0∶2.5.在实验过程中，PHMB溶解在水中，三聚氯氰在水溶液中会发生一定程度的水解而被消耗，生成三聚氰酸[17]，因此，反应过程中三聚氯氰应适当过量，但过量太多会造成原料的浪费.

由图2(c)可知:HTCC和PHMB的质量比对取代度的影响最大；随着PHMB质量的增加，取代度呈增大趋势；当m(HTCC)∶m(PHMB)达到1.0∶1.2时，进一步增大PHMB的量，由于反应位阻的增大，取代度增加不大.因此，选取HTCC和PHMB的质量比为1.0∶1.2.

缚酸剂在一定程度上会影响PHMB的取代度.由图2(d)可知:三乙胺的缚酸效果高于其他缚酸剂.这是因为DIPEA，DMAP，TEA等均会和TCT发生反应，在缚酸的同时也会和原料发生反应[18]，从而影响PHMB的取代度.因此，选择实验的最佳缚酸剂为TEA.

由于位阻的影响，三聚氯氰发生二取代的温度需适当增加[19].由图2(e)，(f)可知：最佳反应时间为14 h，最佳反应温度为40 ℃；随着第二阶段反应温度和反应时间的增加，取代度呈现先增加后减小的趋势.这是因为反应以水为溶剂，三聚氯氰在水溶液中会发生部分水解，随着温度的升高和反应时间的延长，三聚氯氰的水解程度加剧[10].

2.2 元素分析

采用元素分析仪对壳聚糖、壳聚糖季铵盐和胍基壳聚糖季铵盐进行测定，壳聚糖衍生物的元素分析结果，如表3所示.表3中：w(H)为H的质量分数.由表3可知：壳聚糖的脱乙酰度为86.00%；壳聚糖季铵盐的季铵化取代度为43.59%；胍基壳聚糖季铵盐中N的质量分数为15.51%，高于壳聚糖季铵盐中N的质量分数.

表3 壳聚糖衍生物的元素分析与取代度Tab.3 Elemental analysis and substitution degree of chitosan derivatives

2.3 FTIR分析

图3 CS，HTCC和HCP的FTIR图Fig.3 FTIR spectra of CS，HTCC and HCP

采用溴化钾压片法，在IS50型傅里叶变换红外光谱仪上测得CS，HTCC和HCP的红外光谱，如图3所示.图3中：ν为波数.

由图3可知：与CS相比，HTCC的红外光谱图中，1 477 cm-1处出现明显的尖峰为季铵盐中甲基的C-H弯曲振动峰，且在1 599 cm-1处的伯胺N-H的弯曲峰减弱，表明季铵盐基团已引入到壳聚糖的氨基上[20]；在HCP的红外光谱图中，1 604和1 587 cm-1处的吸收峰为C=N的伸缩振动和N-H的弯曲振动[8]，2 921和2 853 cm-1处出现的吸收峰为饱和甲基和亚甲基的伸缩振动峰，在720 cm-1处出现了(-CH2-)n(n≥4)基团的特征吸收峰[21]，表明PHMB已通过三聚氯氰桥梁接枝到HTCC上.

2.4 1H NMR分析

PHMB，HTCC和HCP的1H NMR谱图，如图4所示.图4中：δ为化学位移.由图4可知：4.70对应的是溶剂D2O的特征峰；在PHMB的1H NMR谱图中，3.03处出现的特征峰为PHMB与氨基相连的亚甲基的质子峰，1.40和1.20处的特征峰对应的是远离氨基的4个亚甲基的质子峰；在HTCC的1H NMR谱图中，3.14处出现的尖而强的峰为三甲基季铵盐中甲基的质子峰，1.95处的特征峰为壳聚糖中未脱除乙酰氨基上的甲基质子峰[20]；在HCP的1H NMR谱图中，与图4(b)相比，在1.40和1.20处出现PHMB的特征吸收峰，表明胍基已接枝到壳聚糖季铵盐上.由1H NMR谱图进一步说明已制得胍基壳聚糖季铵盐.

(a) PHMB (b) HTCC (c) HCP 图4 PHMB，HTCC和HCP的1H NMR谱图Fig.4 1H NMR spectra of PHMB，HTCC and HCP

表4 HTCC和HCP的ρMI和ρMB Tab.4 ρMI and ρMB of HTCC and HCP

2.5 抗菌性能

2.5.1 最低抑菌、最低杀菌质量浓度 最低抑菌质量浓度通常用来评价样品对微生物的生长抑制效果.测得两种壳聚糖衍生物HTCC和HCP对E.coli和S.aureus的最低抑菌质量浓度(ρMI)和最低杀菌质量浓度(ρMB)，如表4所示.

由表4可知：HTCC和HCP对E.coli的最低抑菌质量浓度分别为0.625，0.020 mg·mL-1，对S.aureus的最低抑菌质量浓度分别为0.020，0.005 mg·mL-1；而HTCC和HCP对E.coli的最低杀菌质量浓度分别为2.500，0.156 mg·mL-1，对S.aureus的最低杀菌质量浓度分别为0.156，0.010 mg·mL-1.结果表明，HCP的最低抑菌质量浓度明显低于HTCC，说明PHMB的引入显著提高了HTCC对两种细菌生长的抑制作用.这是因为PHMB具有高活性和正电荷，增加了壳聚糖的电荷密度，容易被带负电荷的微生物吸收，进而抑制细菌的活性[8].HTCC和HCP对S.aureus的抑菌效果优于对E.coli的抑菌效果，这可能与细菌的结构有关，E.coli的外壳由外膜和内膜组成，两层膜之间有肽聚糖，而S.aureus由于缺乏外膜，更有利于抗菌剂的进攻，容易被破坏，导致内溶物流出，从而使细菌死亡[22].

2.5.2 抑菌率 为进一步评价HTCC和HCP的抗菌活性，分别测定了不同质量浓度(ρ)下HTCC和HCP对E.coli和S.aureus的抑菌率(η)，结果如图5所示.

由图5可知：HTCC的抑菌效果较差，尤其是对E.coli，当HTCC的质量浓度为1.0 mg·mL-1时，对E.coli的抑菌率为18.2%，当HTCC的质量浓度达到2.5 mg·mL-1时，其抑菌率仅为39.3%；HTCC对S.aureus的抑菌效果稍优于E.coli，且抑菌率随着HTCC质量浓度的增加而增加，当HTCC的质量浓度为1.0 mg·mL-1时，对S.aureus的抑菌率为18.7%，当HTCC的质量浓度达到2.5 mg·mL-1时，其抑菌率可达73.3%，这与最低抑菌质量浓度的结果一致.HTCC接枝PHMB后，可以明显增加其抑菌能力；质量浓度为0.5 mg·mL-1的HCP对E.coli的抑菌率为81.1%，当HCP质量浓度增加到1.0 mg·mL-1时，其对E.coli的抑菌率可达89.8%；质量浓度为0.5 mg·mL-1的HCP对S.aureus的抑菌率可达96.1%，质量浓度为1.0 mg·mL-1的HCP对S.aureus的抑菌率为100%，均高于相同质量浓度下HTCC的抑菌率，这与表4的测定结果一致.

(a) E. coli (b) S. aureus图5 HTCC和HCP对E. coli和S. aureus的抑菌率Fig.5 Antibacterial rate of HTCC and HCP on E. coli and S. aureus

3 结论

以N-(2-羟丙基-3-甲基氯化铵)壳聚糖和聚六亚甲基双胍为原料，三聚氯氰为桥梁，制备胍基壳聚糖季铵盐衍生物，采用元素分析、傅里叶变换红外光谱和核磁共振波谱对产物的结构进行表征，并测定其抗菌性能.正交实验结果表明，胍基壳聚糖季铵盐的最佳反应条件为HTCC和TCT的物质的量比1.0∶2.5，HTCC和PHMB的质量比1.0∶1.2，缚酸剂为三乙胺，三聚氯氰一取代的反应时间8 h，二取代的反应时间14 h，反应温度40 ℃.

抗菌性能测定结果表明，壳聚糖季铵盐经胍基化改性后，可以明显提高其抗菌效果；质量浓度为1.0 mg·mL-1的HCP对E.coli和S.aureus的抑菌率分别为89.8%和100.0%，高于相同质量浓度下HTCC对E.coli和S.aureus的抑菌率18.2%和18.7%.胍基化壳聚糖季铵盐优异的抗菌性能在环境消毒、抗菌纺织面料开发等领域具有潜在的应用前景.