化肥连续施用条件下植烟土壤微生物群落响应特征

刘艳霞，付生华，李想*，王骏飞，张恒，李寒，方正华，袁修堂，徐健，焦剑

生物技术

化肥连续施用条件下植烟土壤微生物群落响应特征

刘艳霞1，付生华2，李想2*，王骏飞2，张恒1，李寒1，方正华3，袁修堂3，徐健2，焦剑2

1 贵州省烟草科学研究院，贵州省贵阳市观山湖区龙滩坝路29号 550000；2 中国烟草总公司贵州省公司，贵州省贵阳市瑞金北路146号 550000；3 福建中烟工业有限责任公司，厦门市思明区莲岳路118号 361000

【目的】为探索土壤微生物对化肥连续施用的响应特征。【方法】选择烟草生产中常用的9种化学肥料，设置减少50%、常规施肥量和增加50%施用量3个肥料浓度梯度，采用土柱模拟系统结合微生物高通量测序、Biolog表型芯片等技术，研究长期不同施肥处理条件下土壤微生物群落的结构、功能基因、生态多样性的变化情况，并构建化肥与土壤微生物关联网络。【结果】（1）连续施用9种化学肥料后土壤微生物群落结构多样性中放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）变化幅度较大，磷肥和复合肥增加放线菌门相对丰度，磷肥减少变形菌门相对丰度。（2）连续施肥条件下，尿素施用量减少50%处理的Shannon指数比初期增加1.77%，氯化钾减少50%处理和常规施肥处理在初期明显提高土壤微生物多样性，后期Shannon指数略有下降，与不施肥空白对照之间无显著差异，烤烟专用复合肥常规施肥处理Shannon指数后期较初期下降35.01%。（3）常规施肥浓度下钙镁磷肥处理的氨基酸与核苷酸运输和代谢基因表达较空白对照增多，氯化钾处理的碳水化合物运输和代谢、转录功能、次生代谢产物合成基因明显高于其他处理，硝酸钾处理的脂质转运和代谢基因表达要高于其他处理。（4）化肥对土壤微生物群落影响从高到低依次为硫酸钾＞硝酸钾＞复合肥料＞磷酸一铵＞硝酸铵＞普钙＞氯化钾＞钙镁磷肥＞尿素。【结论】不同种类化肥连续施用均对土壤微生物群落产生不利影响，复合肥对土壤的冲击作用大于单质肥料，氯化钾的施用对土壤微生物的不利影响程度较轻。

植烟土壤；土柱模拟系统；化肥；微生物群落结构；功能基因；关联网络

烟草是我国重要的经济作物之一[1]。为追求经济利益，烟农每年向土壤中投入大量化肥。据统计，中国农民对化肥的投资约占全部生产性支出的50%[2]。长期不科学施用化肥会导致土壤中重金属的积累[3]。另外，大量的营养元素积累会造成土壤养分失衡、地下水位上升、次生盐渍化和土壤板结的现象，甚至会污染环境[4]。化肥的大量、不合理施用，加之未合理补充有机质导致土壤微生物群落失衡等问题日趋严重[5-8]，土地生产能力下降[9-11]，进而导致烟草产质量下降[12-14]。

化肥的施用对根际微生物群落影响的研究有许多报道[15-17]。随着化肥施用年限的增加，烟田土壤细菌的Shannon指数、Simpson指数和McIntosh多样性指数整体呈下降趋势，土壤细菌和放线菌数量呈明显下降趋势[18]，根际微生物的多样性越来越小，微生物类群由“细菌型”向“真菌型”过渡，细菌/真菌比值下降，病原菌越来越积聚[19]。胡元森等[20]研究发现施用化肥连作3季后黄瓜连作引起土壤中细菌种群发生较大变化，其中噬菌弧菌（sp.）、假单胞菌（sp.）和另两种不可培养细菌种群数量减少，而鞘氨醇单胞菌（sp.）和另外一种不可培养细菌种群数量增加。Ling等[21]研究发现4年施用化肥连作后西瓜根际细菌的多样性下降，连作后微生物优势种群为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门和放线菌门，随连作年限增加，3种优势微生物数量增多，占全部微生物群落的比例增大，导致微生物群落不平衡[22]。

长期定位试验是研究不同施肥处理对土壤长远影响不可替代的研究手段[23]。然而，由于长期定位试验时间跨度大，很难保证定时定点取样检测，且田间试验受到当年气候、农事操作等外界因素的影响，导致试验结果波动大、不稳定，为研究土壤动态变化带来一定的困难。因此，设计一种更为简便、高效的方法模拟研究长期、大量施用化肥对土壤微生物带来的冲击作用，成为现实需要。自从H. Jenny提出“生态样块”学说以来，伴随着实验土壤学的发展，学者们发现可以取一定的土壤胞体代表土壤系统，用以研究系统中物质循环及作物生长的情况，这种方法被称为“土柱试验”[24]。目前，土柱试验最适用于水田土壤系统的研究，一般在营养元素淋溶[25]与重金属迁移[26]等研究中广泛应用，未见其在土壤微生物研究领域的报道。

本研究从长期定位田间不同施肥处理导致烟叶产量和土壤性状差异的现象出发，提出假设：不同化学肥料对土壤微生物影响差异较大，进而设计室内土柱模拟试验，分析9种化肥、3个浓度连续施用下土壤微生物的响应特征，旨在短时期内反映化肥对土壤的持续冲击作用，探索长期不科学施用化肥条件下土壤微生物群落的响应机制，以期为化肥的科学施用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤与肥料

供试土壤为黄壤，质地为重壤土。于2020年取自贵州省烟草科学研究院烟草土壤肥力与肥料效益长期定位试验站（106°07'57. 6″ N, 26°11'34. 5″ E）。供试土壤pH 5.45，有机质48.6 g/kg，全氮2.29 g/kg，碱解氮158 mg/kg，速效磷48.9 mg/kg，速效钾543 mg/kg。

供试肥料种类如下：

化学氮肥：尿素(NH2)2CO（AR）、NH4NO3（AR）；

化学磷肥：钙镁磷肥(P2O5=14.62%)、普钙（P2O5=13.28%）；

化学钾肥：K2SO4（AR）、KCl（AR）；

化学复合肥：NH4H2PO4（AR）、KNO3（AR）、烤烟专用复合肥(N:P2O5:K2O=10:10:20）。

1.2 模拟研究连续施用不同化肥对土壤微生物群落的影响

1.2.1 土柱模拟系统

采用高30 cm直径7.5 cm的 PVC管作为土柱容器（图1），采用塑料薄膜封闭一端，另一端用无菌透气封口膜密封，橡皮筋扎紧；将休耕土壤粉碎过6目筛并混匀，将土壤水分含量调至土壤持水量65%；每个土柱装土2 kg，将土柱随机放入人工气候箱（型号：RGL-P1000D）中进行暗培养，培养箱湿度设为65%，温度设为25℃。

图1 土柱施肥模拟系统

1.2.2 土柱模拟系统试验设计

以烟草土壤肥力与肥料效益长期定位试验实际施肥量为依据，化学氮肥处理各处理常规施用N量为5g/柱/次，化学磷肥各处理施用P2O5量为5g/柱/次，化学钾肥各处理施用K2O为10g/柱/次，化学复合肥处理按照等氮量5g/柱/次计算，在此基础上计算减施50%与增施50%处理肥料施用量。

试验设计：设置9种化学肥料处理和1个空白对照（CK）（表1），各处理设置3个施肥量，即：T1减施化肥50%、T2常规施肥水平、T3增施化肥50%，每次每土柱肥料施用量详见表1。空白对照不加肥料，但与处理间补齐水分。各处理重复5次。

表1 土柱模拟试验不同化肥种类和施用量

Tab.1 Application amount of various chemical fertilizers in soil column simulation system

施肥方法：每隔20 d进行1次施肥和补水，每次施肥量一致，共进行5次施肥和补水，在进行补水和施肥之前检测土壤的水分含量（用称重法）以确定补水量，确保每次补水后土壤水分含量保持一致。每次施肥时，将土柱内土壤倒出，将计算好用量的肥料（提前磨成粉状）和水均匀拌入土中，分级拌入以保证均匀度，完成后再装入土柱。

取样方法：研究化肥对土壤的瞬时影响，以及化肥施用后土壤随时间变化具有的缓冲作用和自我恢复功能。于第一次补水前进行1次取样（20 d样品），用于研究化肥施用后对土壤的瞬时影响。施肥5次后不再施肥，最终在300 d再次取样（300 d样品），用于研究化肥连续施用后，土壤在缓冲作用下对化肥的响应特征。

1.2.3 土壤细菌群落结构多样性及功能基因代谢测定

对300 d土壤DNA采用Soil DNA Isolation Kit（Omega）提取，土壤DNA提取物采用无菌水稀释至1×10-3μg/μL。以DNA为模板，根据测序区域的选择进行PCR扩增。引物对应区域：16S V4区引物为515F-806R，引物采用515F：5’-GTGYCAGCMGCCGC GGTAA-3’和806R：5’-GGACTACNVGGGTWTCTAA- 3’。PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，使用GeneJET 胶回收试盒（Thermo Scientific）回收产物。PCR扩增反应体系以及文库构建、测序和数据分析参见文献[27]。基于宏基因组学测序数据采用PICRUSt (phylogenetic investigation of communities by the reconstruction of unobserved states )（https://github. com/picrust/picrust）预测菌群可能参与的代谢通路[28]。

1.2.4 土壤细菌群落生态多样性测定

根际土壤微生物生态多样性对20d和300d的土壤采用Biolog EcoPlate系统（Biolog Inc. Hayward Cal. USA）比较31种碳源利用情况。土壤悬液在4℃、3000g转速下离心5 min，然后用0.85%的NaCl溶液稀释100倍。土壤稀释液接种于EcoPlates，在Biolog恒温（25℃）培养箱中暗培养72 h。微生物活性用微孔板平均颜色变化度（AWCD）值表示，Shannon指数指征土壤微生物生态多样性[29]。

Shannon Index=-Σln

其中，P=Ai/Atotal，代表第i孔相对吸光度值与整个平板相对吸光度总和的比率，A代表590 nm处吸光度。

Biolog含有31种碳源，根据官能团分为6大类，其中碳水化合物7种，氨基酸6种，羧酸9种，聚合物4种，胺类2种，其他化合物3种。计算300 d土壤样品中的微生物对不同种类碳源的相对利用率，用Biolog微孔板平均颜色变化率（）表示。

式中：A为反应孔吸光值；n为碳源数。

1.3 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2016处理，显著性分析采用SPSS Base Ver.13.0统计软件（SPSS, IL, Chicago, 美国）进行，最小显著差异法（LSD）或邓肯（Duncan）新复极差进行多重比较（<0.05）。

以施肥为源结点、以运算的分类单位（operational taxonomic unit，OTU）为目标结点生成二分图，即结点连接线表示特定OTU与特定施肥或施肥组合的正关联[30]。在Cytoscape（https://cytoscape.org/）中使用边缘加权spring嵌套对象布局算法生成二分图，并根据关联强度对边缘进行加权。使用Spearman相关系数计算分析所有显著（<0.05）相关OTU对之间的OTU互相关。基于此信息，在Cytoscape中使用边缘加权spring嵌套对象布局算法构建关联网络，并根据相关系数对边缘进行加权。

2 结果

2.1 土柱模拟条件下不同种类化肥处理对土壤细菌群落结构多样性的影响

尿素减少50%施用量、常规施用量、增加50%施用量处理的放线菌门相对丰度较空白对照（CK）分别减少25.65%、20.06%和3.73%（图2a），相对丰度随尿素施肥量提高而增加；尿素减少50%施用量、常规施用量、增加50%施用量处理的厚壁菌门相对丰度分别是空白对照（CK）处理的117.1、85.8、和35.4倍，尿素促进土壤厚壁菌门生长，但是随着施肥量升高促进作用减弱，尿素处理对其他微生物相对丰度均有抑制作用；硝酸铵处理的硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、变形菌门、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度随着施肥量提高而增加，绿弯菌门（Chloroflexi）和浮霉菌门（Planctomycetes）的相对丰度减少。

钙镁磷肥处理和普钙处理的放线菌门相对丰度比空白对照分别增加47.25%和53.27%（图2b），而且与施肥量呈正相关关系；变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门和硝化螺旋菌门则呈相反趋势；两种磷肥不同浓度的绿弯菌门丰度虽与空白对照相近，但OTU总量要明显高于空白对照。

硫酸钾减少50%施用量、常规施用量、增加50%施用量处理的放线菌门相对丰度分别比空白对照增加6.98%、14.95%、17.64%（图2c），随着硫酸钾施肥量的提高，3种不同施肥量处理变形菌门相对丰度小于或与空白对照相当，硫酸钾不同施肥量处理之间厚壁菌门相对丰度差异并不显著，OTU总量高于空白对照。随着氯化钾施肥量增加，变形菌门、厚壁菌门和浮霉菌门相对丰度呈增加趋势。

复合肥处理对放线菌门的促进作用排序依次为磷酸一铵>烤烟专用复合肥>硝酸钾（图2d）；磷酸一铵和烤烟专用复合肥对变形菌门抑制作用明显，而硝酸钾处理对其有促进作用，硝酸钾各梯度处理较空白对照（CK）处理分别提高3.71%、10.15%和7.47%；3种复合肥处理对酸杆菌门具有明显的抑制作用，抑制作用依次为磷酸一铵>烤烟专用复合肥>硝酸钾；磷酸一铵和硝酸钾处理对绿弯菌门具有抑制作用；硝酸钾和烤烟专用复合肥处理对厚壁菌门其有促进作用而磷酸一铵具有抑制作用。

注：a-不同施肥量氮肥；b-不同施肥量磷肥；c-不同施肥量钾肥；d-不同施肥量复合肥。

2.2 土柱模拟条件下不同种类化肥处理对土壤细菌群落生态多样性的影响

在20 d的土壤样品中，氯化钾和硝酸钾施用量减少50%处理的Shannon指数之间无显著差异，均显著高于空白对照，分别增加了5.90%和3.39%，其余化肥处理均显著低于空白对照；氯化钾和硝酸钾常规施用量处理的Shannon指数与空白对照之间无显著差异，硫酸钾与硝酸钾施用量增加50%处理的Shannon指数之间无显著差异均显著高于空白对照，分别增加了6.78%和5.01%；尿素和硝酸铵处理与空白对照之间无显著差异。经过长期不同种类化肥施用后（300 d样品）的土壤，尿素和氯化钾施用量减少50%处理的Shannon指数均小于空白对照，但两处理之间无显著差异；氯化钾常规施用量处理的Shannon指数与空白对照之间无显著差异；所有化肥施用量增加50%处理的Shannon指数均显著小于空白对照，其中磷酸一铵和尿素仅为空白对照的57.14%和59.91%。

由图3可以看出，空白对照中土壤微生物对羧酸类和聚合物的利用率显著高于化肥处理，对碳水化合物的利用略高于尿素和烤烟专用复合肥，但比其它化肥显著降低41.9%～50.0%。除尿素外，其他单质肥料与复合肥相比，土壤微生物对碳水化合物的利用率都显著提高。使用含氮肥料后土壤微生物对氨基酸类物质的利用率显著低于不含氮化肥，而对羧酸类物质利用的趋势与对氨基酸类物质利用效率相反，单质肥料比复合肥相比显著减少对羧酸类物质利用，减少最多的为硝酸钾，其比复合肥对羧酸利用率减少22.2%。结果表明，不同种类的化肥连续施用导致土壤微生物的代谢功能发生了变化。

表2 不同种类化肥处理对土壤细菌群落生态多样性的影响（Shannon多样性指数）

注：平均值多重比较采用One-way ANOVA Duncan法，数据后标有不同的小写字母表示处理间差异有统计学意义（<0.05）。

Note: Data is expressed as means±s.d.(n=3) and multiple comparison was performed using One-way ANOVA Duncan method. Different lowercase letters indicate that difference is of statistical significance at<0.05.

图3 不同种类化肥施用条件下土壤微生物群落对Biolog 6类碳源的相对利用率

2.3 土柱模拟条件下不同种类化肥处理对土壤细菌群落代谢基因的影响

对长期施用不同种类化肥常规施用量下的土壤微生物代谢基因的变化进行分析，结果表明（图4），钙镁磷肥处理的氨基酸与核苷酸运输代谢基因表达较空白对照分别上调89.5%和86.4%；氯化钾处理的碳水化合物运输和代谢基因显著高于其他处理，比空白对照增加74.6%；硝酸钾处理的脂质转运和代谢基因表达高于其他处理，比空白对照增加16.5%；所有处理间其他代谢基因表达与空白对照之间无明显差异。

注：A-尿素；B-硝酸铵；C-复合肥；D-钙镁磷肥；E-普钙；F:磷酸一铵；H：硫酸钾；M-氯化钾；N-硝酸钾；CK-空白对照。

2.4 不同种类化肥处理对土壤细菌群落相关网络的影响

使用双向关联网络（bipartite association network）对OTU与不同施肥措施之间的关联进行可视化构建，结果表明（图5），9481个重要OTU的关联强度（即度中心，指OTU与其它微生物建立连接的数量）大小为0.202～0.346。在这些OTU中，有54.23%与硫酸钾施用密切相关，只有34.13%与复合肥料相关，证实了不同施肥措施对微生物群落影响的差异。加权程度表示施肥重要性，从高到低依次为硫酸钾＞硝酸钾＞复合肥料＞磷酸一铵＞硝酸铵＞普钙＞氯化钾＞钙镁磷肥＞尿素＞空白对照。在关联网络的三个维度上，氯化钾、硝酸钾和硝酸铵之间的空间关系紧密，而复合肥与空白对照的空间关系相对紧密。在另一个集群中，除了磷酸一铵之外，包括尿素，硫酸钾和过普钙在内的单质化学肥料也属于同一聚类簇（一个数据集里的一组点）。

注：A-尿素；B-硝酸铵；C-复合肥；D-钙镁磷肥；E-普钙；F:磷酸一铵；H：硫酸钾；M-氯化钾；N-硝酸钾；CK-空白对照。

3 讨论

长期不同的施肥处理对根际微生物影响的研究较多[5, 15, 21]，但长期定位试验需要时间跨度较大，烟草的连作障碍问题导致许多植烟土壤定位试验不足5年就面临报废的境地，目前贵州省植烟土壤长期定位持续15年的肥料效益评价试验仍在开展，主要通过烟草-玉米轮作方式来解决烟草连作障碍问题。对于长期不科学施用化肥且不轮作处理下植烟土壤酶活性变化、土壤微生物活性的变化及发展趋势等还缺乏深入的研究。本研究采用室内模拟植烟土壤长期不同化肥处理，研究土壤微生物群落变化，化肥种类、浓度均参照田间实际生产，且研究过程不受气候、地型、农事操作等影响，研究结果具有较强的指导意义。

长期使用不同的化肥对土壤微生物群落结构多样性的影响显著不同。在本研究中尿素、硫酸钾、磷肥（钙镁磷肥、普钙）和磷酸一铵随着施肥量的增加提高放线菌门相对丰度，氯化钾、烤烟专用复合肥和硝态氮肥（硝酸铵和硝酸钾）随施肥量的增加降低放线菌门相对丰度，高量氮肥的施用导致放线菌门受到抑制[31]。变形菌门相对丰度仅次于放线菌门；尿素和含磷肥料处理下的变形菌门较空白对照低，除钙镁磷肥和硫酸钾，变形菌门OTU总数与施肥量呈正相关，变形菌门相对丰度高低排序为钾肥>含铵态氮的肥料>磷肥。Zhao等[32]研究长期定位条件下不同耕作方式微生物区系差异，发现土壤微生物中α-Proteobacteria与速效K含量成极显著正相关、与总氮成负相关、与有效磷成显著负相关，与本研究中不同肥料类型变形菌门变化趋势相同。厚壁菌门大多数细菌具有极强的抗逆性和适应性，在极端生态环境中发挥重要作用[33]，不同种类肥料处理下厚壁菌门的相对丰度排序为含铵态氮的肥料>钾肥>磷肥。Marina等[34]也研究发现在几乎无法培养微生物的矿渣中添加一定量的氮营养后，厚壁菌门数量得到增加。酸杆菌门主要降解动植物残体以及参与铁载体的循环，促进植物诱导抗性反应[35]。本研究发现，不同肥料对酸杆菌门的相对丰度排序为钾肥>含硝态氮的肥料>磷肥>含铵态氮的肥料，此结果与Zhao等[32]研究长期定位条件下不同耕作方式微生物区系差异的结果相似，即酸杆菌门受速效钾含量影响。

Shannon指数是表征微生物群落多样性的重要指标。本研究中，除氯化钾外的其它化肥无论是减量、常规还是增量处理，长期施用后土壤微生物群落多样性都显著低于空白对照，表明长期施用化肥会破坏微生物生态系统的平衡。长期施肥条件下尿素施用量减少50%处理Shannon指数比初期增加1.77%，氯化钾减少50%处理和常规用量处理在初期明显提高土壤微生物多样性，在长期施肥条件下Shannon指数略有下降，但与空白对照之间无显著差异。前人研究发现扁豆和甜瓜根际单施尿素条件下微生物群落多样性也会略有提高[36-37]。郭帅等[38]研究发现尿素+氯化钾处理的氨氧化细菌和氨氧化古菌的基因丰度均较高（0.05）。综合比较不同处理氨氧化细菌和氨氧化古菌的DGGE条带的多样性以及定量分析得出结论，尿素+氯化钾处理的氨氧化微生物多样性和功能基因最丰富，建议生产上采用尿素与氯化钾搭配施，有利于土壤氨氧化微生物的活动和氮素循环利用。刘晓燕等[39]研究发现长期施用氯化钾显著影响玉米生育前期根际土壤真菌和放线菌数量，对根际土壤细菌数量影响不明显。另有研究表明施用含氯化钾的肥料显著影响土壤微生物的组成及数量，其中G+细菌显著降低，真菌和放线菌数量变化不大[40]，这主要是由于该研究在稻-麦轮作体系中氯化钾长期施用，厌氧-好氧转换下的土壤氧化还原反应剧烈，进而抑制了土壤氨氧化能力、硝化能力[41]。

本研究发现9种化肥中只有钙镁磷肥、氯化钾和硝酸钾处理的代谢基因高于空白对照，钙镁磷肥的氨基酸与核苷酸运输和代谢基因表达增多，可以用来改善土壤微生物氮素循环[42]，而氯化钾处理的碳水化合物运输和代谢、转录功能基因、次生代谢产物合成基因显著高于其他处理，上述基因与土壤微生物碳代谢有着密不可分的联系[43]。迄今为止，研究较多的功能基因多与碳、氮等元素的物质循环过程相关，其它生态过程（例如磷循环）还没有相关的功能基因研究结果，仍值得进一步深入探讨[44]。

本研究未对所有具有统计意义的结果进行全面讨论，重点研究了施肥后土壤微生物最显著影响，例如微生物的结构和功能以及互相关网络，主要采用“三步法”策略来检索土壤微生物对不同施肥的反应的信息。首先检测了门水平上，不同肥料的土壤微生物群落结构；然后预测了不同肥料之间代谢基因的调控；最后阐明了微生物与不同施肥之间的相互作用和相关性。此种研究策略既聚焦微生物种类与功能对肥料连续施用的响应，又重点关注微生物种间复杂的关联关系，为土壤微生物作用整体发挥提供技术支持。

4 结论

土壤微生物活性是土壤肥力的重要指标，不同种类化肥长期施用均对土壤微生物群落产生不利影响，氯化钾的施用对土壤微生物的不利影响程度较小，尿素、钙镁磷肥以及氯化钾的施用可以调节土壤微生物代谢基因的表达。不同种类化肥连续施用均对土壤微生物群落产生不利影响，影响从高到低依次为硫酸钾＞硝酸钾＞复合肥料＞磷酸一铵＞硝酸铵＞普钙＞氯化钾＞钙镁磷肥＞尿素，表明复合肥料的影响大于单质化学肥料的影响。

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Response characteristics of microbial community structure in tobacco-planting soil under repeated application of chemical fertilizers

LIU Yanxia1, FU Shenghua2, LI Xiang2*, WANG Junfei2, ZHANG Heng1, LI Han1, FANG Zhenghua3, YUAN Xiutang3, XU Jian2, JIAO Jian2

1 Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550000, China;2 Guizhou Tobacco Company, Guiyang 550000, China;3 China Tobacco Fujian Industrial Co., Ltd., Xiamen 361000, China

This study aims to explore the response characteristic of soil microorganisms to repeated application of chemical fertilizers.In this paper, experiments were conducted by using nine kinds of commonly used chemical fertilizers under three fertilizing gradients (50% fertilizing amount, conventional application amount and 150% fertilizing amount) using soil column simulation system combined with microbial high-throughput sequencing, Biolog phenotype chip technology, in order to study the changes of soil microbial community structure, functional genes and ecological diversity under repeated application of different fertilizers and establish the association network between fertilizer and soil microorganisms.The results show that (1) the diversities of Actinobacteria and Proteobacteria dramatically changed after repeated application of 9 chemical fertilizers. Phosphate and compound fertilizers increased the relative abundance of Actinobacteria, while phosphate reduced the relative abundance of Proteobacteria. (2) At 50% fertilizing amount of urea, the Shannon index increased by 1.77% compared with the initial stage. The application of potassium chloride with 50% fertilizing amount and normal fertilizing amount obviously increased soil microbial diversity at the initial stage, but the Shannon index decreased slightly at the later stage, showing no significant difference with that of CK. The Shannon index of compound fertilizer specific for flue-cured tobacco under normal fertilizing amount decreased by 35.01% in the later period. (3) The expression of amino acid and nucleotide transport and metabolism genes of calcium-magnesium phosphate fertilizer under normal fertilizing amount were up-regulated compared with CK. The expressions of functional genes of carbohydrate transport and metabolism, transcription, secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism of potassium chloride treatment were significantly higher than other treatments. The expression of lipid transport and metabolism gene of potassium nitrate was the highest among treatments. (4) The effect of chemical fertilizers on soil microbial community from high to low was potassium sulphate> potassium nitrate> compound fertilizer> monoammonium phosphate> ammonium nitrate> calcium superphosphate> potassium chloride> calcium magnesium phosphate> urea.In summary, the repeated application of different chemical fertilizers will negatively affect soil microbial community. Compound fertilizers have greater impact than single chemical fertilizer. Moreover, the application of potassium chloride has less negative impact on soil microorganisms.

tobacco-planting soil; soil column simulation system; chemical fertilizer; microbial community structure; functional gene; co-correlation networks

. Email：newcool1361214@163.com

刘艳霞，付生华，李想，等. 化肥连续施用条件下植烟土壤微生物群落响应特征[J]. 中国烟草学报，2022，28（6）. LIU Yanxia, FU Shenghua, LI Xiang, et al. Response characteristics of microbial community structure in tobacco-planting soil under repeated application of chemical fertilizers[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022,28(6).doi:10.16472/j.chinatobacco.2022.011

国家自然科学基金“连作条件下导病抑病型植烟土壤根际微生物群落演替及生物修复”（31860597）；院士工作站（黔科合平台人才[2020]4004）；中国烟草总公司贵州省公司科技项目“根际增氧技术促进有机肥养分转化的研究与应用”（201905）；中国烟草总公司贵州省公司科技项目“基于烟叶特色香气品质彰显的土壤微生物调控技术研究与应用”（2021XM18）；中国烟草总公司贵州省公司科技项目“烤烟根系趋化菌群重建抵御青枯菌机制及应用研究”（2022XM03）；福建中烟科技项目“福建中烟贵州基地单元高品质上部烟叶开发技术集成研究与应用”（2021350000340504）

刘艳霞（1982—），博士，副研究员，主要研究方向为植烟土壤保育及土传病害生物防控，Tel：0851-84116909，Email：liuyanxia306@163.com

李想（1982—），Tel：18685188016，Email：newcool1361214@163.com

2022-01-25；

2022-08-16