肠道菌群与肿瘤免疫治疗疗效及不良反应关系的研究进展

程思远 韩子翰 郭晓欢 沈琳 综述 彭智 审校

以程序性死亡受体(Programmed cell death-1，PD-1)及其配体(Programmed cell death-ligand 1，PD-L1)为代表的免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors，ICIs)革命性地改变了肿瘤的内科治疗方式。与化疗作用机制不同，PD-1/PD-L1通路属于肿瘤免疫逃逸通路，PD-1常表达于活化的CD8+T细胞等免疫细胞表面，肿瘤细胞表面表达其配体PD-L1和PD-L2，与PD-1结合后，抑制宿主免疫系统对肿瘤细胞的识别与杀伤。PD-1/PD-L1单抗抑制通路的激活，可恢复宿主免疫细胞对肿瘤的杀伤功能。其他免疫检查点细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白-3(T cell immunoglobulin-3，TIM-3)和淋巴细胞活化基因-3(Lymphocyte activation gene-3，LAG-3)等也有相应的抑制剂上市或在研，其中PD-1/PD-L1抑制剂和CTLA-4抑制剂是目前临床应用较为广泛的ICIs。

免疫耐药是限制患者取得免疫治疗临床获益的主要原因。导致免疫耐药的具体机制尚不清楚。肠道菌群是哺乳动物肠道内细菌、病毒、真菌和原生动物等微生物的总称。近年来，随着基因测序技术的不断发展与进步，对菌群的研究及认识也愈发深入。肠道菌群可以通过多种方式影响宿主免疫状态，因此与肿瘤的发生发展、治疗应答等密切相关。自2017年起，多项研究显示肠道菌群组成状态在黑色素瘤、非小细胞肺癌等癌种中与ICIs治疗疗效相关(表1)。本文将对该领域近2年关键性的研究进展及相关不足进行系统性综述，以期为后续相关研究提供一定的帮助。

表1 肠道菌群与肿瘤免疫治疗疗效主要研究结果总结

1 肠道菌群及代谢产物可用于预测免疫检查点抑制剂疗效

1.1 肠道菌群组成状态可以预测胃肠道肿瘤免疫治疗疗效

胃肠道是肠道菌群赖以寄生的环境，原发于胃肠道的肿瘤破坏了这一寄生环境，肠道菌群组成状态发生改变，主要表现为肠道菌群多样性的增加及以拟杆菌属为代表的一些菌株丰度增加[1-2]。因此，菌群对宿主免疫的调控也更加复杂，这可能是胃肠道肿瘤免疫治疗整体疗效不佳的原因之一。北京大学肿瘤医院团队的研究首次证实了肠道菌群状态与免疫治疗疗效有关。队列共纳入了74例胃肠道肿瘤患者(包括食管癌、胃癌、结直肠癌等)。总体而言，普氏菌属/拟杆菌属的比值与免疫治疗获益呈正相关。在一个特定的治疗应答亚组中，普氏菌、瘤胃球菌和毛螺菌丰度显著增加。核苷和核苷酸生物合成、脂质生物合成、糖代谢和短链脂肪酸(Short-chain fatty acids，SCFA)发酵相关的通路在不同疗效的患者中存在差异。基于菌群测序数据，团队构建的疗效预测模型体现了良好的疗效预测价值[3]，提示肠道菌群是较为可靠的肿瘤免疫治疗疗效预测生物标记物。

1.2 嗜粘蛋白艾克曼氏菌(Akkermansia muciniphila，Akk)与非小细胞肺癌免疫治疗疗效

Akk是近几年十分热门的“新型益生菌”，尤其是在非小细胞肺癌患者中，Akk与免疫治疗的关系似乎更为密切。回顾性研究显示Akk在非小细胞肺癌和肾细胞癌患者中与更好的免疫治疗疗效相关，Akk相对丰度高的患者更易取得免疫治疗获益[4]。一项前瞻性研究显示[5]，在接受一线或二线免疫治疗的非小细胞肺癌患者中(n=338)，与Akk未检出组(Akk-)相比(n=207)，Akk检出组(Akk+)(n=131)的客观缓解率(28%vs.18%，P=0.04)和总生存期(18.8vs.15.4个月，HR=0.72，95%CI：0.73～1.62，P=0.03)更优。因此，Akk有潜力成为独立的疗效预测生物标记物。同时，该研究通过对肿瘤组织的RNA测序分析发现，Akk有助于提升肿瘤免疫微环境内辅助性T细胞1的募集及再循环。此外，肠道菌群中Akk阳性的患者，整体菌群α多样性更高，并有更丰富的瘤胃球菌及毛螺菌科菌株。

1.3 不同的黑色素瘤研究队列之间结果差异较大

黑色素瘤是最早应用ICIs的实体瘤之一，也是肠道菌群相关研究数据最为丰富的癌种。近期发表的一项研究纳入了五个来自不同国家或地区的黑色素瘤队列，同时也纳入了既往已发表研究中的147例患者[6]，汇总分析发现与疗效相关的菌群组成特征具有队列特异性。机器学习提示包括假链状双歧杆菌、罗氏菌属、Akk在内的多个菌株与免疫治疗疗效呈正相关。类似的是，同期发表的另一项荟萃分析纳入了四个已发表的黑色素瘤队列以及该团队的研究队列[7]，研究发现毛螺菌属和链球菌属分别与免疫治疗获益及不获益相关，并有助于识别免疫相关不良反应，尽管队列间存在差异，基于批量校正后菌群测序数据的机器学习模型依然显示出了良好的疗效预测价值。

1.4 肠道菌群代谢产物可能是更精准的生物标记物

作为肠道菌群的下游产物，肠道菌群代谢产物可能是更精准的免疫治疗疗效预测生物标记物。SCFAs是研究较多的菌群代谢产物，碳链中碳原子小于6个的有机脂肪酸统称为SCFA，主要包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等。SCFA可能通过调节CD4+T细胞[8]、CD8+T细胞功能[9-11]、增加肿瘤微环境免疫细胞浸润[11]等途径参与调控抗肿瘤免疫。一项纳入了52例接受帕博利珠单抗治疗实体瘤患者的研究显示，粪便中包括丁酸、丙酸和异戊酸等在内的SCFA的丰度与更长的无进展生存期(Progression-free survival，PFS)呈正相关[12]。然而，在接受CTLA-4抑制剂治疗的小鼠荷瘤模型中显示，外周血较高的丁酸和丙酸水平与CTLA-4抑制剂耐药以及较高水平的Treg相关。小鼠中，CTLA-4抑制剂可以诱导树突状细胞上CD80/CD86和T细胞上诱导性共刺激分子(Induciblc costimulator，ICOS)表达的上调，以及肿瘤特异性T细胞和记忆性T细胞的富集，丁酸盐抑制了上述过程。在黑色素瘤患者中，外周血中丁酸盐水平较高的患者中和了伊匹木单抗诱导的记忆性和ICOS+CD4+T细胞富集以及IL-12的浸润[13]。这种相互矛盾的结果提示，在SCFA相关的研究中，研究分层需要更为细致，机制探索应当更加深入。肌苷是假长双歧杆菌的代谢产物，免疫治疗后肠道黏膜屏障功能降低，肌苷异位并激活抗肿瘤效应的T细胞，肌苷的这种效应依赖于T细胞表达的腺苷A2A受体[14]。除SCFA和肌苷外，有研究显示吲哚及其衍生物、酮及醛化合物可能也与免疫治疗疗效相关，但机制尚不清楚[15]。

肠道菌群与免疫治疗疗效的相关性毋庸置疑，如何将相关性转化为临床应用是目前的研究重点，上述几项研究初步探索了肠道菌群在免疫治疗疗效预测中的价值。然而，在这几项研究中，无论是不同癌种之间，还是同一癌种之间，与疗效相关的菌群特征均缺乏可重复性，这限制了肠道菌群成为一种可行的泛癌种的疗效预测生物标记物。导致这一现象的原因可能是以下两点：(1)菌群的影响因素较多。例如，不同的饮食对于菌群的影响是不同的，以脂肪和蛋白质为主的动物性饮食主导了拟杆菌的定植，碳水化合物则更多的影响普氏菌定植。此外，还有居住环境、合并用药等因素，也可能影响菌群的组成，因此，在构建临床队列时，应当尽量将上述因素考虑在内；(2)缺乏全面而深入的机制探索。特定菌株在肿瘤免疫治疗中调控宿主免疫的具体机制、不同菌株对免疫调控的异同应为后续研究所关注。此外，菌株与其下游代谢产物对免疫系统的协同调节作用也应当予以重视。

2 肠道菌群参与调控免疫治疗相关不良反应

免疫检查点抑制剂具有较为独特的不良反应，由于用药后激活了自身免疫，且自身正常组织中也会表达PD-L1等免疫检查点，免疫激活可能会导致免疫系统攻击正常组织进而引起包括自身免疫性甲状腺炎、肺炎、肝炎、肠炎等一系列免疫治疗相关不良反应(Immune-related adverse events，irAEs)。大多数患者的不良反应轻微，但小部分患者不良反应较重，甚至可能威胁生命。目前，irAEs发生发展的影响因素仍不完全清楚，是困扰临床实践的重要问题，目前已有研究报道了肠道菌群与irAEs具有相关性。

有研究者探索了发生irAEs患者的菌群特点。在黑色素瘤患者中，接受伊匹木单抗联合纳武利尤单抗治疗的患者，有高危irAEs风险的患者可见肠道中多氏拟杆菌富集，并存在更多的腺苷代谢相关通路，而低危患者中则以普通拟杆菌富集为特点[20]。肠道菌群中双歧杆菌(P=0.001)和脱硫弧菌(P=0.0002)相对富集的肺癌患者不容易出现irAEs[21]。在一项纳入了150例肿瘤(非小细胞肺癌占68%)患者的真实世界研究中，研究者比较了发生不同程度irAEs患者的菌群差异，irAEs根据不良事件通用术语评价标准(Common Terminology Criteria for Adverse Events，CTCAE V5.0)定义为轻度(CTCAE 1～2级)和严重(3～5级)。其中，发生严重irAEs的患者，链球菌、拟杆菌和窄食单胞菌的丰度显著增加，发生轻度irAEs的患者肠道中粪便杆菌、未分类的毛螺菌更富集[22]。

另有研究发现特定irAEs患者的菌群特征。例如在发生了免疫相关急性胰腺炎的患者中，基线肠道菌群在门水平中具有较低拟杆菌/厚壁菌的比例，在属水平上具有较低水平的拟杆菌、另支菌和较高水平的毛螺菌[23]。黑色素瘤患者中，接受伊匹木单抗治疗的患者，基线普拉梭菌和Gemmiger formicilis等厚壁菌门菌与免疫相关结肠炎发生有关，而拟杆菌门的细菌则在免疫相关结肠炎中起保护作用[24]。最近另一项研究得到了不同的结果，在接受CTLA-4抑制剂联合PD-1抑制剂治疗的黑色素瘤患者中，肠道拟杆菌的丰度与免疫相关结肠炎相关，临床前模型显示，肠道拟杆菌可能通过上调黏膜IL-1β的水平，参与免疫相关结肠炎的发生发展[25]。

3 干预菌群改善免疫耐药

随着肠道菌群与肿瘤免疫治疗相关研究的深入，调节肠道菌群是否可以改善免疫耐药得到了极大的关注。粪菌移植(Fecal microbiota transplantation，FMT)是最直接的调节肠道菌群的方法，可大致分为移植单一菌群和移植整体菌群两种主要方式。最近，FMT的一项大型Ⅲ期临床试验研究公布了结果，在难治性艰难梭菌感染的患者中，使用SER-109(一种提纯的厚壁菌孢子)治疗显著降低了患者的复发风险，且不良反应可控[26]。这一研究进一步确认了粪菌移植作为一种独立治疗方法的可行性。在肿瘤领域，一项回顾性研究提示，补充丁酸梭菌MIYAIRI 588菌株可以改善接受免疫治疗的晚期非小细胞肺癌的生存[27]。近期，一项前瞻性Ⅰb期临床试验研究显示，转移性肾细胞癌患者中，在伊匹木单抗联合纳武利尤单抗的基础上给予MIYAIRI 588，ORR(58%vs.20%，P=0.06)及PFS(12.7个月vs.2.5个月，HR=0.15，95%CI：0.05～0.47，P=0.001)增加，且未增加3/4级副反应的发生率[28]。

整体移植有效患者的肠道菌群也是FMT的可行方式。在原发免疫耐药的黑色素瘤患者中，将10例接受PD-1抑制剂治疗后进展的患者随机分为两组，分别移植了来自两例PD-1抑制剂治疗后实现完全缓解并持续超过1年的黑色素瘤患者的粪便菌群，同时进行PD-1抑制剂的再挑战。10例患者移植前基线菌群特征无显著差异。接受1号供体FMT的5例患者中，共有3例患者达到了临床缓解，其中1例达到了完全缓解，另有1例患者表现为部分病灶缓解、部分其他病灶增大。然而，在接受2号供体移植的患者中，没有患者达到临床缓解。FMT总体安全性良好。研究者对患者移植前后的粪便样本、肠道和肿瘤组织样本进行了分析，在接受了1号供体的粪便菌群移植的患者中，肠道内抗原提呈细胞(Antigen presenting cells，APC)活性、先天免疫和IL-12相关基因集表达上调，肿瘤组织内免疫相关基因集如T细胞活化、干扰素γ介导的相关信号通路等上调，同时局部免疫细胞浸润增加。在接受2号供体的患者中没有观察到类似现象。但是在接受1号供体的5例患者之间，应答情况的差异性仍无法得到很好的解释[29]。另一项研究纳入了16例PD-1抑制剂原发耐药的黑色素瘤患者，随机接受来自7例供体的粪便菌群移植(4例供体接受PD-1治疗后疾病完全缓解，3例部分缓解，中位PFS为56个月)，同时进行PD-1抑制剂的再挑战。移植后有3例患者实现了疾病缓解，3例患者疾病控制稳定并维持超过12个月。总体安全性良好。进一步分析发现FMT后免疫治疗获益患者的肠道菌群迅速转化为供体的菌群特征，并产生了供体菌群特异性的IgG。获益的患者在移植后厚壁菌门和放线菌门增加，拟杆菌门减少。后续的分析提示获益患者的循环CD8+T细胞更活跃且分化更好，循环IL-8和IL-18水平下降[30]。

联合使用其他抗肿瘤药物间接改变菌群是改善免疫耐药的潜在可行方案。联合治疗是临床中最常见的改善免疫耐药的方式，常见的方案包括免疫联合化疗、免疫联合靶向药物、双免疫检查点联合治疗等，均取得了一定的效果。然而，联合药物的选择、给药方式的选择(同时给药、先后给药)等还存在一定的争议。上述问题似乎可以从肠道菌群的角度找到答案。化疗药物和靶向药物可以影响肠道菌群状态。如化疗药物紫杉醇用药后可以导致肠道中艾克曼氏菌的丰度显著降低[31]。舒尼替尼和卡博替尼是多靶点的小分子络氨酸酶抑制剂，广泛用于肾细胞癌和肺癌等癌种，研究发现，舒尼替尼和卡博替尼治疗后，艾克曼氏菌和Alistipes.senegalensis丰度增加，后者也具有调控免疫系统应答的作用[32]。因此，联合上述可以促进肠道菌群向增敏免疫治疗方向改变的药物是值得探索的方向。在方案实施时，尝试优先给予改变菌群的化疗/靶向药物，菌群变化并稳定后再给予免疫治疗药物，是否可以更有效地改善免疫耐药并提升获益，值得进一步研究。具体的联合方案以及给药时间还需要更多的前瞻性队列研究进行验证。

此外，有研究显示我国传统医学也可能通过改善肠道菌群提升免疫治疗疗效。葛根芩连汤在荷瘤小鼠模型中(BALB/c小鼠，CT26肠癌细胞系种瘤)可以增加部分拟杆菌菌株相对丰度水平，并促进甘油磷脂代谢和鞘脂代谢通路富集。研究者认为菌群的改变与外周血及肿瘤组织CD8+T细胞富集有关[33]。在人体中，葛根芩连汤是否能达到类似的免疫促进效果仍需要进一步的研究。

目前已有一系列研究初步证实了FMT是改善免疫治疗耐药的可行手段，而通过联合其他药物间接调节菌群也已有一定的理论基础。但是，现有的研究中，由于缺乏足够深入且清晰的机制研究，仍无法完全实现“精准治疗”，一定程度上也限制了更大规模的临床应用。

4 小结与展望

肠道菌群与免疫治疗疗效及不良反应的关联均已得到充分证实，干预菌群是可行的增敏免疫治疗疗效的方法。现阶段，无论是预测疗效、不良反应还是菌群移植，均欠缺精准性。“精准”应当是围绕菌群研究的关键词，一方面，肠道菌群是肿瘤精准治疗的重要组成部分，另一方面，由于肠道菌群的影响因素众多，肠道菌群相关的研究需要更加的精准，也需要更多的关注机制。除肠道菌群之外，口腔菌群、肿瘤内菌群和肿瘤原发部位菌群(如支气管内菌群)等也是不容忽视的影响因素。全面而系统的评估菌群状态，并在菌群的基础上结合包括单细胞测序、蛋白组学在内的多组学研究方法，可能是研究者未来关注的方向。