核酸适配体在肿瘤液体活检中的应用

田彩平 李瑞 马佰菁 闵建平 荆晓 杨碎胜

1.甘肃省医学科学研究院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050

众所周知，癌症是引起死亡的一个主要原因，也是世界性难题。若能早期发现肿瘤，就可以进行早期干预，从而提高疗效，减少死亡，因此肿瘤的早期发现至关重要［1］。目前肿瘤标记物、医学影像以及穿刺活检是主要的肿瘤诊断方式，其中肿瘤标记物是检测肿瘤生长过程中分泌到血液中的特异性蛋白质含量，医学影像是借助X 光、CT、核磁等技术进行检测病灶，穿刺活检是通过穿刺或外科手术的方式取得肿瘤组织，这三种诊断方式均存在局限性，不能在肿瘤早期检测到疾病信息而错过最佳治疗时机，从而导致肿瘤患者治愈率低，生存期短［2］。因此，寻求一种能够在肿瘤早期阶段方便检测的方法至关重要。

新兴的液体活检可以实时反映原始组织的生理和病理状态，能够在疾病早期被检测出来，可以方便无创的取样。与传统有创的活检相比，液体活检具有及时、个体化诊疗的优势。然而，液体活检在检测靶标的有效分离、信号放大等方面存在不足，而核酸适配体由于其特殊的空间构象，可以进行修饰和组装，从而可以进行信号放大，能够弥补液体活检存在的不足。本文从液体活检的类型、优缺点，核酸适配体在肿瘤液体活检中的应用、优缺点等方面进行综述，为肿瘤的早期检测提供参考依据。

1 液体活检的主要检测靶标及在肿瘤检测中的优点和不足

1.1 液体活检的主要检测靶标 液体活检是一种源自体液的疾病诊断和监测工具，体液主要有血液、脑脊液、唾液、尿液等，它们要么在体内循环，要么在体外分泌，具有营养输送、废物收集以及润滑等一系列生理功能，随着现代医学和分析技术的发展，在体液中发现了越来越多的生物分子、细胞外囊泡甚至细胞，它们可以作为疾病管理的标记物具有重要的临床价值［3］。检测分析这些体液靶标（循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和外泌体（Exosome）可以实时、全面、动态的反映原始组织的全局生理和病理信息，其结果可以对肿瘤进行早期筛查、指导治疗、监测疗效和监控复发［4-5］。

1.2 液体活检在肿瘤检测中的优点和不足 液体活检与传统肿瘤诊断方式相比，具有很多优势。首先，液体活检能够诊断出疾病的早期阶段，使及时治疗成为可能；其次，液体活检可以方便且无创的进行取样，使疾病筛查更便捷，即使稀少的样本也能检测到，样本还可以进行重复检测和分析；再次，液体活检能够提供全面、动态的病理信息来精准全面的指导疾病诊断和治疗方案［6］。同时它们在实际应用中存在一些不足［7］，如CTCs 在体液中含量极低，很难被捕获和识别到，并且体液是相对复杂的基质，特别是外周血中有数十亿血细胞和很多种蛋白质，捕获和识别都需要高效富集和高信号放大策略。ctDNA 存在检测方法不统一，缺少标准化流程。外泌体在分离、分析灵敏度等方面技术受到限制。此外，脆弱的检测靶标需要温和的分离和释放方法进行下游分析，不同程度的异质性检测靶标需要综合的检测分析方法，克服这些困难需要高特异性和高灵敏度的靶标检测技术。核酸适配体检测方法的出现弥补了液体活检的不足。

2 核酸适配体的特性及其在不同肿瘤液体活检中的应用

2.1 核酸适配体的特性 近年来，广泛研究的核酸适配体由于其具有独特的空间构象，能够与病毒、细菌和细胞等多种靶点高特异的结合，它是利用指数富集的配基进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）从大容量的寡核苷酸随机文库中迭代筛选出来的一类具有特异性识别功能的单链DNA 或RNA 核酸分子，它易于被合成，并根据靶标特点通过体外方法进行修饰，便于高效筛选到与核酸适配体高特异性、高亲和力结合的检测靶标，更便于检测信号的放大和检测靶标的充分释放［8］。该技术于1990 年首次报道，后续开发出了许多改良的SELEX技术，并结合高效的筛选平台和生物信息学工具，核酸适配体检测方法促进了CTCs、ctDNA 和外泌体等液体活检的发展，分别于2009 年、2012 年和2016 年探索了基于核酸适配体的检测靶标分离方法、释放策略以及用于CTCs 研究的亚群分析平台［9］。

2.2 核酸适配体在肿瘤液体活检中的应用 核酸适配体在肿瘤诊疗中作为识别配体，其性质决定其亲和力、特异性和稳定性等性能。亲和力决定核酸适配体与检测靶标之间的结合力，从而影响检测效率和灵敏度。核酸适配体的特异性识别保证了检测的选择性和可靠性，核酸适配体三级结构的稳定性在实际应用中非常重要。许多针对特定肿瘤生物标志物的核酸适配体已被开发应用于液体活检中检测靶标的捕获和分析，比如黏液蛋白1（MUC1）和表皮生长因子受体2（HER2）的核酸适配体［10-11］，CD63 和 HSP70 的胞外结构域已成为开发特异性核酸适配体的目标，用以分离和分析外泌体［12-13］。在此，我们总结了现有的一些成功应用于不同肿瘤液体活检的核酸适配体（表1）［14-16］。但是在亲和力、特性性以及稳定性方面还需大力提升，因此许多努力致力于研发亲和力强、特异性高和稳定性好的核酸适配体筛选方法。

表1 核酸适配体在不同肿瘤液体活检中的应用

3 核酸适配体检测的灵敏度、特异性方面的优势

3.1 核酸适配体具有提高亲和力的优势 核酸适配体的亲和力决定了其结合性能，从而决定了检测靶标的高效分离和灵敏检测，一些核酸适配体的亲和力有限，同时复杂的基质通常会对核酸适配体的亲和力和稳定性有害，因此提高核酸适配体的亲和力是实际应用中亟待解决的问题。为了解决这一问题在生物系统中引入多价核酸适配体，以增强核酸适配体与不同活性细胞的亲和力，多价核酸适配体即一个实体上的多个配体与另一个实体上的一个或多个受体同时结合，受此启发，核酸适配体采用各种策略来设计多价组件作为识别元素来提高亲和力，常用的方法有杂交、聚合和基于纳米结构的多价组装［17］。为了提高检测靶标的特异性，核酸适配体是在严格的筛选条件下和适当的消减条件下进行筛选，如在连续流动的微流控中进行孵育有助于产生高度特异性的核酸适配体，与传统的孵育方法相比，流动的流量可以抑制大约50 倍的非特异性结合的寡核苷酸，因此消减筛选是消除寡核苷酸非特异性结合的关键过程。Li 等［18］利用高转移性MDA-MB-231 细胞进行正向性筛选，利用低转移性MCF-7 细胞进行反向筛选，实现了特异性靶向转移细胞的适配体M3 的筛选，此外，基于M3 的捕获系统成功地从转移乳腺癌患者得到的转移性表型细胞捕获到了CTCs，因此，筛选高特异性识别的适配体有助于检测靶标的选择性捕获和分子分型。

3.2 核酸适配体具有多价组装的优势 由于检测靶标存在于复杂的体液中，所以灵敏的检测需要检测靶标的有效分离和富集，体液的复杂成分会影响检测信号，尤其是血液样本，一毫升血液中含有大于109个红细胞、107个白细胞、大于108个血小板，以及几十毫克的蛋白质和有机小化合物，这种复杂的基质会在电化学检测时引起电极污染，在光学检测时引起自荧光、光散射以及吸附，因此检测靶标的有效分离和富集是提高检测效率和灵敏度的关键。核酸适配体具有许多独特的特性，首先，由体外SELEX 进化而来的各种核酸适配体可以全面准确地识别液体活检的检测靶标；其次，核酸适配体的合成具有较低的批量变异性，可以方便地制备成多价纳米组装体，具有官能团和小分子的位点特异性修饰允许高度定向和高密集的界面功能化，这些优点都有助于高亲和力捕获界面的设计［19］。随着材料科学和微/纳米技术的发展，迄今为止，许多微/纳米材料和微/纳米工程装置已经被制造出来，为液体检测提供了多功能、稳健和高效的分离平台，将核酸适配体整合到各种平台中（包括磁性材料、微/纳米结构基质和微流控芯片）可以整合核酸适配体和平台的优点。

3.3 核酸适配体具有信号放大的优势 检测靶标的灵敏性分析对于准确和可靠的疾病诊断很重要，但是体液中某些类型的检测靶标浓度较低，因此检测靶标的灵敏检测需要信号放大策略，与其他识别配体相比，核酸适配体具有众多独特的组成和结构特征，在信号放大方面有优势［9］，核酸适配体探针含有不同的信号放大基团，它与靶标结合时提供多种直接放大策略，包括DNA 扩增/组装和酶催化反应，或者对于与触发序列杂交的核酸适配体探针，核酸适配体-靶标相互作用竞争性地释放触发序列以进行信号放大，基于核酸适配体的信号放大策略有直接放大和竞争放大。

4 展望

核酸适配体用于液体活检具有的诸多优点和应用潜力，但是目前大多数核酸适配体的特性尚未得到充分研究，只有极少数核酸适配体被批准用于临床。全面的液体活检仍需要靶向各种检测靶标的多种核酸适配体。此外，在复杂的基质中，核酸适配体结合性能的降低使得基于核酸适配体的液体活检变得困难，迄今为止，已有多种策略来提高核酸适配体的稳定性和亲和力，如对核酸酶敏感位置的核酸适配体序列进行化学修饰和多价组装，然而这两种方法都使核酸适配体的应用复杂化，并且化学修饰有时会影响核酸适配体的特异性和亲和力，因此核酸适配体的多样性、亲和性以及稳定性有望进一步提高，需要更先进的SELEX 技术。其次，CTCs 和外泌体携带着丰富的生物信息，这些生物信息是现有基于核酸适配体的液体活检难以获得的，由于CTCs 和外泌体高度的异质性，它们不同的亚群与肿瘤的转移有不同的相关性，但是基于核酸适配体亲和力的分离依赖于特定生物标志物的表达，这会导致CTCs 和外泌体的特定亚群检测不出来，从而无法提供准确和全面的信息，影响了肿瘤液体活检的临床价值。再次，标准化的处理程序和集成设备是临床转化的重要前提，借助商业仪器和试剂盒以及成熟方案，这些基于核酸适配体的肿瘤液体活检方法将实现从工作台到床边的平稳过渡。最好，具有质量控制和标准化操作程序的商业试剂盒将确保基于核酸适配体的液体活检方法可靠和并具有重复性。

综上所述，通过核酸适配体特性的改善、检测靶标的综合分析策略和相应的商用设备的开发、临床应用可行性验证等方面的共同努力，基于核酸适配体的液体活检有望推动肿瘤诊疗的发展。