循环肿瘤细胞的研究现状及在结肠癌诊疗中的应用进展*

成端辉 黄韦政 赖应森 雷国坚

癌症转移是癌症相关死亡的主要原因，且仍然是癌症治疗中的主要挑战之一。癌症转移是一个复杂的多步骤过程，包括癌细胞在原发部位的侵袭、血管内渗入循环、循环中的存活、循环外渗及转移部位的附着和定植[1]。癌细胞从原发性肿瘤脱落渗入血液并在血液中循环后被称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）[2]。CTC 具有移动、迁移和侵入血管的能力，被认为是体内肿瘤转移的主要原因[3]。由于CTC 直接来源于肿瘤且是活的细胞，因此CTC 携带有原发性肿瘤和转移灶的分子和生物学信息，可用于早期疾病检测、治疗反应和疾病进展评估、疾病机制阐明和药物开发的治疗靶点识别等，是一种有前景的生物标志物[4-5]。结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，常见于40～50 岁男性，是全球第三大常见的癌症，每年导致近100 万人死亡[6]。结肠癌在我国的发病率与死亡率低于胃癌、食管癌、肺癌等常见恶性肿瘤，但近年随着饮食结构的改变，其发病率呈逐年上升趋势[7]。早期发现和精准治疗是改善结肠癌患者预后的关键。过去，结肠癌的确诊主要依靠活检技术，但单个静态活检标本无法实时反映肿瘤的特征。因此，迫切需要一种更安全、更实时的方法来获取全面、动态的信息，以反映癌症的发展和治疗反应，以补充或替代实体组织活检[8]。CTC 具有提供大量生物信息的潜力，同时支持单细胞分析，引起了研究人员的广泛关注。

多项研究表明，CTC 对评估结肠癌的预后很有价值。CTC 检测有利于结肠癌的早期诊断和监测动态变化，同时，CTC 的表型和分子特征与原发灶和转移灶类似，有助于揭示结肠癌的发病机制和转移机制，并识别靶基因中的特定突变[9]。但是，CTC的稀有性和异质性及检测和分析技术的发展限制了CTC 作为一种新的生物标志物的推广应用。本综述将概述CTC 的研究现状，并讨论CTC 检测在结肠癌患者中的效用以及前景。

1 CTC富集和分离技术

有研究表明，CTC 在医学影像学检查检测到肿瘤病变前就存在于血液，但含量极低[10]。即便到了肿瘤晚期，患者1 mL 外周血中通常只有1 个CTC[11]。此外，当肿瘤细胞脱离原来的组织后容易发生表型变化，易受细胞凋亡和固有的脆性影响，只有少数细胞可以存活[11]。因此，CTC 的捕获难度较大，尤其是发明可有效检测活CTC 以进行后续深入分析的分离方法仍然是一个巨大的挑战。

1.1 基于CTC 物理特性捕获技术 物理富集和分离方法是基于CTC 的物理特性，利用尺寸、膜电荷和密度等方面与血细胞的差异，通过特定平台进行分离[12]。如AccuCyte 系统的原理是利用CTC 的特定密度。CTC 的密度介于血浆和红细胞之间，利用密度介质的不同沉降系数梯度离心，不同密度的细胞在分离液中分层分布，实现CTC 的分离[13]。也可利用膜电位差异来检测和计数CTC。阿尼尔等构建了双电层门控AlGaN/GaN 高电子迁移率晶体管生物传感器阵列实现了CTC 的捕获[14]。但白细胞和CTC 之间存在一些物理性质的重叠，这导致物理方法获取的CTC 特异性差及一些CTC 丢失。

1.2 基于CTC 生物特性捕获技术 生物富集和分离方法是利用CTC 特定的表面标记分子，使用分子探针，如抗体、肽链和配体等靶向识别标记分子，再通过分选系统筛出CTC，常见的标记分子有EpCAM+、DAPI+、CD45-、细胞角蛋白+等[15]。最具代表性的分选系统是CellSearch 系统[16]。CellSearch 系统首先利用涂有EpCAM 抗体的免疫磁珠与样本细胞孵育和分离，然后使用抗细胞角蛋白抗体识别CTC 细胞，使用CD45 抗体识别混杂的白细胞，最后通过流式分选出高纯度的CTC。CellSearch 系统已被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌患者的诊断。

近年来，也出现了多种基于EpCAM 的CTC 富集和分离新技术。Cui 等[17]构建了一种具有特异性捕获和非破坏性释放癌细胞双重功能的新型三维微纳生物芯片，该芯片可以高效捕获的CTC，且对细胞活力损伤小。纤维垫是一种可用于分选特异性CTC 的纳米材料，Lee 等[18]优化了以尼龙6 为主要材料的纤维垫，将环氧乙烷混合到尼龙6 中，提高了纤维垫的细胞基质亲和力和低白细胞吸附能力，提高了对CTC 的分离效率和样品纯度。但基于生物特性的方法仍存在缺点，即不能有效地分离具有非特异性表面抗原表达的CTC。

1.3 最新CTC 捕获技术 除了上面讨论的经典CTC 富集与分离技术外，近年来还出现了一些较新的技术，如基于微流体和基于纳米技术的CTC 富集与分离。

微流体捕获技术结合了生物和物理捕获技术两种方法的优点，利用循环内在特性（如流体动力）与人为外在干预（如磁场、电场、声学和光学力）来分离细胞，提高了CTC 富集与分离的灵敏度和特异度。Jiang 等[19]设计集成了一种微流控系统，可以快速、高灵敏度检测CTC。该系统利用流体特性，在血液中捕获绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞实现了90%的捕获率、50%的纯度和90%以上的成活率。在转移性癌症患者中该系统的阳性捕获率为83.3%。该系统与CellSearch 系统的捕获率无统计学差异，但该系统具有血量、时间和成本的优势，且对细胞活性没有影响。

基于纳米技术的CTC 富集与分离方法目前在疾病早期检测CTC 和动态监测癌症发展方面展现出了良好的前景。纳米材料的优点是具有大的表面积与体积比，因此可以结合更多的抗体或配体与CTC 特异性结合，进而高效分离纯化CTC。目前用于CTC检测的纳米材料包括磁性纳米粒子、金纳米粒子、量子点等[20]。

2 CTC的生物学信息

CTC 是从原发性肿瘤脱落渗入血液并在血液中循环癌细胞。它的来源决定了它携带有与原发性肿瘤和转移灶癌细胞相似的生物学信息，识别CTC 的生物学信息有助于理解原发疾病的发病机制和治疗靶点识别等[21]。

2.1 CTC 的分子特征 CTC 主要的分子特征包括上皮标志物、间充质标志物和癌症特异性CTC 标志物[22]。掌握CTC 的分子特征将有助于癌症的早期诊断和预防转移。目前乳腺癌、前列腺癌、大肠癌、胃癌、食道癌等10 余种癌症的CTC 特异性分子已经被发现和应用[23]。如乳腺癌中的上皮标志物EpCAM/CK/E-钙黏蛋白、间充质标志物波形蛋白、特定标记HER2；前列腺癌中的特定标记PSMA；肾癌中的特定标记CD147；大肠癌中的特定标记PI3Kα/CEA 等。

由于大多数癌症是上皮起源的，因此最常用于识别CTC 的标志分子是EpCAM。但使用EpCAM 作为CTC 标记有局限性。它不能用于EpCAM 阴性或低表达的肿瘤，如神经源性癌症。即便在EpCAM高表达的肿瘤中，仅检测EpCAM 阳性CTC 可能会低估了实际的CTC 数量，在某些癌症类型中，在EpCAM 高表达的肿瘤中存在大量EpCAM 阴性CTC[24]。因此，综合使用上皮标志物、间充质标志物和癌症特异性CTC 标志物的检测方法，在检出CTC 上更具可靠性。

2.2 CTC 的基因组特征 组织基因分型是传统上公认的癌症诊断金标准方法，用于识别人类基因组改变。然而，这种技术是一种高侵入性、昂贵且耗时的方法，不适用于少量肿瘤组织或癌症的后续治疗。CTC 基因组分析可以提供有关肿瘤细胞突变谱的信息，帮助临床医生选择治疗方法和对患者进行随访。

特别是使用非侵入性液体活检连续取样分离CTC 检测肿瘤的基因组的稳定性，可早期发现肿瘤进化和耐药肿瘤亚克隆的出现，有助于评估治疗反应和精准医疗。但许多癌症的CTC 基因突变分析显示，CTC 和相应的原发性肿瘤之间的突变不完全一致，因此可能会干扰对病情的评估[25]。如一项结直肠癌CTC 的研究显示，CTC 和原发肿瘤之间的突变一致性率为37%～90%[26]。因此，CTC和肿瘤样本的突变检测相结合才能更准确地指导治疗。

随着单细胞测序的发展，目前针对CTC 转录组的研究被应用在了癌症的诊断和预后上。如Magbanua 等[27]发现转移性乳腺癌患者中CTC 高表达Ki-67 的预后不良。

3 CTC的临床应用

目前，临床上对乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌等多种癌症已经将CTC 检测作为组织活检的替代或补充方案。通过液体活检定期监测循环中的CTC，从而实现对疾病过程的监测、检测新出现的耐药性基因、识别新的分子靶点。CTC是癌症转移的主要原因，因此监测CTC 在癌症诊断、治疗、预后评估上有巨大的应用潜力。

3.1 癌症的早期诊断 计算机断层扫描、磁共振成像等影像学上检测到肿瘤病变时，肿瘤实体至少已经具有109个肿瘤细胞。而在多项小鼠模型实验中，研究者发现乳腺癌、胰腺癌80% 的转移灶来自早期播散性癌细胞，表明CTC 的出现可能是癌症进展中非常早期的事件[11]。而在人早期乳腺癌研究中，Barrière 等[28]在41%的T1期和47%的腋窝淋巴结阴性乳腺癌患者中检测到CTC，早于影像学发现病灶。上述发现表明CTC 在影像学未察觉肿瘤实体前已经存在。因此CTC 可以应用在癌症早期诊断。但CTC 数量少、和白细胞生物学特性有重叠，导致早期检测的敏感性有限，阻碍了它们作为早期癌症诊断中的有效生物标志物的使用。

3.2 癌症的治疗方案 通过检测CTC 基因突变，可以监测肿瘤耐药性和筛选有效的治疗靶点。如确定EGFR 突变的状态对于接受酪氨酸激酶抑制剂治疗的非小细胞肺癌患者至关重要。Maheswaran 等[29]对29 例非小细胞肺癌患者进行CTC 检测发现，发生癌症转移的患者中92%发生了EGFR 激活突变，对酪氨酸激酶抑制剂治疗效果不佳，特别同时检测到T790M 突变的患者，该突变导致患者对酪氨酸激酶抑制剂耐药，无进展生存期明显缩短。

3.3 预后监测指标 CTCs 的预后价值已被广泛研究。迄今为止，大量研究已经证明CTC 在患有各种类型实体瘤（尤其是乳腺癌）患者中的预后意义。一项统计研究汇总了21 项研究包含2 239 例乳腺癌患者新辅助化疗前的CTC 计数，计算CTC 计数对患者生存的影响，结果显示CTC≥5 个/mL 的患者预后较差[29]。此外，在治疗期间CTC 计数增加或未能清除也提示治疗反应不好，预后不良。同时，研究发现，CTCs 的分子表型亦具有很强的预后价值。如在EpCAM 阳性乳腺癌患者中CTC 过表达WIST1与较差的预后相关[30]。

4 CTC在结肠癌中研究进展

结肠癌是一个重大的全球公共卫生问题，是发达国家最常见的实体癌类型之一。早期发现和精准治疗是改善结肠癌患者预后的关键。目前早期结肠癌的标准治疗包括手术切除原发性结肠肿瘤和区域淋巴结，以及经过手术后被认为仍有癌症复发风险的患者进行辅助化疗[31]。目前CTC 在结肠癌诊疗中的应用主要集中在癌症诊断和病情进展检测。

4.1 应用CTC 诊断结肠癌 目前，结肠癌的诊断主要依靠组织病理活检及影像学检查。然而，这两种方法均是建立在肿瘤实体组织已经较大的基础上，无法做到真正的早期诊断。研究已经表明CTC比影像学可见出现更早，因此可以用于癌症的早期诊断。有研究表明结肠息肉患者和非转移性结肠癌患者的CTC 计数存在显著差异[32]。这些差异为疾病筛查和疑似恶性病变的诊断提供了潜力。2019 年一项台湾前瞻性临床研究使用CellMax 仿生平台进行早期CRC 筛查，对667 份样本（235 名健康对照、120 例癌前病变患者和312 例Ⅰ～Ⅳ期结肠癌患者）进行CTC 检测，将CTC 检测结果与结肠镜检查、活检等常规临床诊断方法的结果进行比较，总体准确率为86%[33]。该研究进一步证明CTC 对结肠癌具有较大的诊断价值。

4.2 应用CTC 检测结肠癌进展 经过手术后被认为仍有癌症复发风险的患者需要进行辅助化疗。辅助化疗的目标是根除临床上未发现的微小转移性病灶从而到达治愈。然而，目前缺乏评估早期癌症患者是否需要辅助化疗的可靠评估指标。在目前的临床实践中，患者选择辅助化疗是基于术后肿瘤的临床病理学特征，但这不精确，会导致大量患者治疗不足或过度治疗。新兴研究表明，CTC 是携带肿瘤特异性基因组或表观基因组改变的游离细胞，可作为是否存在微小转移性病灶的标志物，并有助于对早期结肠癌患者进行高精度的风险分层[34-35]。同时，研究报道，连续监测CTC 可以提供有关结肠癌术后疗效的有价值信息，并且能比影像学监测方法更早地检测到癌症复发[25，36]。

CTC 的检测和分析是研究全身肿瘤异质性、促进精准医疗发展的新途径。近年的研究使CTC 在结肠癌患者中的临床应用取得了重大进展。CTC 不仅可以用于早期诊断，更重要的是可以在基因组、转录组、蛋白质组和功能水平上表征和监测肿瘤异质性的动态变化。但是CTC 检测的敏感性有限，这限制了它在指导辅助治疗决策和肿瘤监测方面的广泛临床应用。CTC 在结肠癌中的应用研究目前主要集中在早期诊断和检测微小转移病灶的潜力。CTC 在新辅助治疗中评估治疗反应的能力是未来探索有前景的一个领域。