一株蝙蝠轮状病毒的分离和基因组分析

柴萨萨，马晓华，赵 静，宋敬东，李金松，李利利，裴银辉，段招军

A组轮状病毒(RVA)是引起全球<5岁儿童重度胃肠炎以及重症腹泻的最主要的病原。RVA感染导致的幼儿死亡人数每年达到128 500～215 000[1]。轮状病毒属于呼肠病毒目(Reovirales)平滑呼肠病毒科(Sedoreoviridea)轮状病毒属，是无包膜二十面体病毒，其基因组由11个双链RNA片段组成，编码6个结构蛋白(VP1～4、VP6和VP7)和6个非结构蛋白(NSP1～6)。编码外层衣壳蛋白的VP7和VP4基因可以独立地刺激机体产生中和抗体，同时也决定RVA的G/P型[2]。GP分型是轮状病毒常用的分型系统，但由于轮状病毒包含11个节段，因此基于VP4和VP7的分型对拥有11个节段的RVA不够完整，轮状病毒分类小组(Rotavirus Classification Working Group，RCWG)建立了基于11个基因片段的RVA最新分类和命名系统，RVA的11个节段VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5分别对应Gx-Px-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx基因型[3]。由于轮状病毒分节段的基因组特点，易发生重配(Reassortment)。当来自不同宿主的RV同时感染同一宿主时，则可能将RV的11个节段包装为1个病毒颗粒，则发生重配。重配的发生在轮状病毒的进化和多样性中发挥重要作用[4]。

蝙蝠是重要的病毒储存库，具有丰富的病毒多样性，其中包含许多对人类具有高致病性的病毒，包括埃博拉病毒、尼帕病毒和狂犬病毒等[5]。随着高通量测序技术的发展，病毒宏基因组学已广泛用于蝙蝠病毒组的分析，并发现了大量新病毒[6]。近10多年来，多个研究报道了在蝙蝠中检出轮状病毒，其中以A组轮状病毒最为常见，目前已鉴定出20多株蝙蝠RVA毒株[7]，其中包括一些重配毒株。本研究从中国云南省的中华菊头蝠中分离并鉴定了1株RVA毒株，通过全基因组分析确定其基因型，并对病毒株进行了同源性和系统进化分析，提示该病毒可能为多宿主来源的重配株。

1 材料与方法

1.1 样本采集 2016年7月至9月，在中国云南省普洱市江城县捕获了84只蝙蝠。解剖蝙蝠并收集肝、肺、脾和肠道内容物，用干冰运回中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，储存于-80 ℃冰箱待用。本研究遵循相关法律和根据中国疾控中心病毒病预防控制所动物伦理相关规定。

1.2 样本处理 剪取0.1 g左右的肠道组织，放入装有预冷钢珠的1.5 mL离心管中，加入1 mL DMEM培养基后用组织研磨仪(信仪-24)研磨3 min，然后7 155×g离心10 min后取上清液；将84份肠道内容物按照每个样本库20～30份样本混合为3个样本库；采用0.22 μm针头滤器(Millipore，美国)过滤以去除宿主细胞和细菌等颗粒物；每个样本库取173 μL悬液加入7 μL的DNase I (Thermo Fisher，美国)和20 μL的10×DNase buffer于37 ℃水浴消化1 h，去除样本中游离的核酸后立即进行核酸提取。

1.4 通过扩增蝙蝠的细胞色素b基因部分片段进行蝙蝠种类鉴定 按照上述样本处理方法研磨肌肉组织后离心取上清直接进行提取核酸。采用TAKARA的Premix Taq扩增553 bp的片段，并将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后送至北京天一辉远公司进行Sanger测序，测序结果通过BLAST比对确认蝙蝠种类。扩增引物：上游引物CytS：ATGACCAACATYCGIAAATCHCAYCC，下游引物CytA：GGAGGAAGTGCAGGGCRAAR-AATCG。反应条件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

1.5 全基因组序列扩增 根据生物信息学分析结果，所获得的拼接序列设计引物对拼接序列进行验证和扩增，将上述制备的肠道内容物悬液提取核酸首先采用SuperScript II Reverse Transcriptase试剂盒(invitrogen，美国)进行逆转录，然后采用Premix TaqTM(TaKaRa)进行PCR扩增，并采用RACE方法扩增11个节段的末端序列，PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，将含有目的条带的PCR产物送至北京天一辉远公司进行测序。

1.6 序列分析和系统发育树构建 使用DNAStar软件包中SeqMan子程序将测得的序列进行拼接，采用BLAST在线比对工具将序列与GenBank数据库进行比对，使用 RVA 自动分型工具(https://www.viprbrc.org/brc/rvaGenotyper.spg?method=ShowCleanInputPage&decorator=reo)对全基因组11个节段进行分型。在GenBank数据库分别下载11个节段的相关参考序列。利用MEGA10.0软件对该毒株序列和参考株序列进行比对，之后用DNASTAR中MegAlign进行序列同源性分析。使用MEGA10.0软件采用最大似然法构建系统发育树，Bootstrap设置为1 000个重复。

1.7 病毒的分离培养 取MA104细胞铺于6孔板，细胞密度为3×105/孔，培养24 h后细胞达到70%左右单层细胞时接种病毒样本，首先将上述阳性样本上清采用0.22 μm滤器过滤，经无EDTA的胰蛋白酶(15 μg/mL)和CaCl2(800 μg/mL)活化处理后，接种至铺好MA104细胞的6孔板中，吸附2 h，期间每20 min摇晃板子，以使病毒重新分配，弃去液体并用PBS清洗2次，再加入DMEM 2 mL，并加入终浓度为5 μg/mL的无EDTA的胰蛋白酶，放入5% CO2培养箱中37 ℃培养，每天观察细胞病变效应(CPE)，当CPE达80%时，收集培养的病变细胞，冻融3次，离心取上清。

1.8 电镜观察 收集第3代病变细胞及细胞培养液，冻融3次，2 000×g离心10 min，取上层清液；取普通碳支持膜铜网(400目)，辉光放电30 s，吸附上清液，磷钨酸染色，置于Tecnai12透射电子显微镜(FEI，荷兰)中观察。

1.9 PAGE电泳鉴定 为了表征该病毒株的电泳型，从分离的第5代病毒中提取RNA，取20 μL的RNA样品加5 μL的RNA上样缓冲液(非变性)混匀，在10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳(PAGE)首先80V的电压电泳30 min后，调为70 V电泳6 h，电泳结束后，取下胶块，使用碧云天的快速银染试剂盒进行银染并拍照。

1.10 生长曲线 将MA104细胞以细胞密度1×105/孔铺于48孔板中，培养1 d后，采用上述方法接种病毒，每间隔12 h收集细胞培养液上清。参照本实验室建立的方法合成RotaA-NSP3的引物(RVA-F：5′-ACCATCTACACATGACCCTC-3′；RVA-R：5′-GGTCACATAACGCCCC-3′)和探针(RVAP FAM：ATGAGCACAATAGTTAAAAG-CTAACACTGTCAA)，按照AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit说明书扩增，反应条件：45 ℃ 20 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。计算各时相病毒的基因组拷贝数，并绘制生长动力学曲线。

2 结 果

2.1 全基因组分析和基因型 对采集的84只蝙蝠的肌肉组织中细胞色素B基因(cytochromeB，Cytb)进行PCR鉴定，84只蝙蝠分别属于2种，包括中华菊头蝠(Rhinolophusaffinis，R.affinis)17只，小蹄蝠(HipposiderosPomona，H.Pomona)67只。通过生物信息学分析发现，1个样本库中存在11 437条reads与RVA高度同源，拼接序列中包含全部11个节段的几乎全长的轮状病毒相关序列，根据拼接序列设计了VP1、VP2和VP3三对特异性引物，采用特异性半巢式RT-PCR筛查所有84份蝙蝠肠道内容物样本，仅1只中华菊头蝠中检测到RVA，阳性率为1.19%。采用RT-PCR和RACE方法获得了该病毒11条基因的全长或几乎全长序列，其中VP1(3 286 bp)、VP2(2 676 bp)、VP3(2 551 bp)、NSP1(1 580 bp)、NSP2(997 bp)和NSP3(990 bp)获得全长序列，VP4(2 315 bp)、VP6(1 331 bp)、VP7(1 007 bp)、NSP4(716 bp)和NSP5(614 bp)获得几乎全长序列。依据RCWG建立的基于11个基因片段的GARV 最新分类和命名系统，该轮状病毒基因型为：G3-P[3]-I8-R3-C3-M3-A9-N3-T3-E3-H6。将其命名为CHYNC82，规范化的命名为：RVA/Bat-tc/CHN/CHYNC82/2016/G3P[3]。CHYNC82的11条基因组序列均已上传至GenBank数据库，序列号为ON221571-ON221581。

分型结果显示，CHYNC82的基因型与我国云南省菊头蝠发现的RVA毒株MSLH14的全部11个节段的基因型完全相同，而与我国云南省蝙蝠发现的轮状病毒MYAS33毒株和泰国腹泻病人中发现的THA/MS2015-1-0001毒株除VP4的基因型不同外(MYAS33和THA/MS2015-1-0001均为P[10])，其余10个节段的基因型相同；此外，CHYNC82与阿根廷发现的1株马的轮状病毒ARG/E3198毒株除VP6基因型不同外(ARG/E3198的VP6基因型为I3)，其它10个节段的基因型也完全相同。到目前为止，这类轮状病毒基因型的组合报道较少(表1)。

表1 CHYNC82的基因型及其与其他代表性RVA株的核苷酸序列同源性Tab.1 Genotype of CHYNC82 and its nucleotide sequence homology with other representative RVA strains

2.2 同源性和系统发育分析 与相近的其他参考RVA毒株进行同源性比较，CHYNC82的11个节段同源性为83.3%～98.1%，多数节段与蝙蝠来源的轮状病毒株MYAS33和MSLH14同源性最高，但部分节段与来源于人和灵长类的轮状病毒株同源性最高。见表1。

2.2.1 结构蛋白的同源性和系统发育分析 VP7糖蛋白和VP4刺突蛋白具有特异的抗原表位，均可诱导宿主产生中和抗体，决定轮状病毒的G/P基因分型。同源性分析结果显示，CHYNC82的VP7与猿猴的RRV株、泰国清迈分离的人罕见CMH222株和蝙蝠MSLH14株具有类似的同源性，分别为90.2%、90.1%和90.0%；系统进化分析显示，CHYNC82作为外源支与3株人的RVA(CMH222株、CMH079株和QUI-140-F1株)处于同一进化分支，核苷酸序列同源性为89.0%～90.4%(表1，图1)。CHYNC82的VP4基因与人CMH222株的同源性最高，为94.6%；系统发育树也显示CHYNC82与CMH222株聚在一起，处于同一进化支的还有山羊GRV株和蜜袋鼯SG33株(同源性87.4%～90.5%)(表1，图1)。

RVA的中间层由VP6基因组成。同源性分析显示，CHYNC82的VP6与狗和猫的RVA同源性最高，分别为83.3%和83.1%，其次为人的CMH222和泰国腹泻病人的MS2015-1-0001株相近，同源性分别为82.0%和81.1%。系统进化树显示，CHYNC82的VP6基因作为外源支与人CMH222株、FRNM株、MS2015-1-0001株以及蝙蝠MSLH14株聚为同一进化分支(表1，图1)。

RVA的核心层由VP1、VP2和VP3三个基因节段共同组成。同源性分析显示CHYNC82的VP1基因与蝙蝠MYAS33株同源性最高，为98.1%，其次是猿猴TUCH株，同源性为92.2%；系统进化分析显示，CHYNC82的VP1基因与蝙蝠MYAS33聚为一支。而VP2基因与猿猴TUCH株和人09US7118株亲缘关系近，同源性均为91.5%，且系统进化树显示作为外源支与这两株病毒聚为一簇；VP3基因与人MS2015-1-0001株同源性最高，为92.8%，系统发育树也显示CHYNC82与人MS2015-1-0001株聚为同一分支，然后与蝙蝠MSLH14株和MYAS33株聚为一个大的分支(核苷酸序列同源性91.2%～91.6%)(表1，图1)。

注：●标注为本研究发现的病毒株；黑色方框为与CHYNC82处于同一进化支同源性最高的毒株。图1 CHYNC82结构蛋白基因组的进化分析Fig.1 Evolutionary analysis of the CHYNC82 structural protein genome

2.2.2 非结构蛋白的同源性和系统发育分析 RVA的5个基因片段编码5～6个非结构蛋白(NSP1～5/6)。同源性分析显示CHYNC82的NSP1基因与人MS2015-1-0001株及蝙蝠LZHP2和MSLH14株具有相近的核苷酸同源性，为87.9%、87.3%和87.1%。系统进化分析显示，NSP1基因与蝙蝠MYAS33、YSSK5、MSLH14株处于同一分支，然后与人MS2015-1-0001株和猿猴TUCH株聚为一个大的分支。NSP2、NSP3和NSP4基因均与MYAS33株同源性最高，分别为94.4%、93.1%和88.3%；系统发育树也显示这3个非结构蛋白与蝙蝠来源轮状病毒聚在一起。NSP5基因与人MS2015-1-0001株同源性最高，为92.8%；系统发育分析显示，CHYNC82与人MS2015-1-0001株和蝙蝠MSLH14株聚为一个分支(表1，图2)。

注：●标注为本研究发现的病毒株；黑色方框为与CHYNC82处于同一进化支同源性最高的毒株。图2 CHYNC82非结构蛋白基因组的进化分析Fig.2 Evolutionary analysis of the CHYNC82 nonstructural protein genome

2.3 抗原位点分析 轮状病毒VP8*是与宿主受体结合的区域，对VP8*序列比对分析发现，在9个重要的抗原结合位点(R101、V144、K146、Y155、G187、Y188、Y189、S190、T191)中，CHYNC82与人CMH122病毒株的全部9个位点均相同，而与来自泰国腹泻病人的MS2015病毒株只有5个位点(R101、K146、Y189、S190、T191)相同。研究表明VP8*的第189位氨基酸是唾液酸受体结合至关重要的位点。当蝙蝠的LZHP2病毒株的189位点为半胱氨酸(C189)时则不能结合唾液酸，而突变为“C189Y”后，则可以与唾液酸结合[9]。本研究发现CHYNC82的189位点为“Y”，且人轮状病毒和部分蝙蝠轮状病毒相同。见图3。

图3 CHYNC82与相关病毒VP8*重要抗原结合位点分析Fig.3 Analysis of important VP8* antigen binding sites between CHYNC82 and related viruses

2.4 病毒的分离、培养与鉴定 将阳性样本接种至轮状病毒易感MA104细胞，初次传代，48 h后观察到轻微的CPE，细胞变圆，胞内颗粒增加，细胞变暗、脱落。在72 h至96 h细胞完全脱落(图4A、C)。采用针对轮状病毒VP6抗原的胶体金进行定性检测，结果为阳性。

注：A为病毒培养72 h的细胞对照；C为病毒培养72 h的CPE；B和D为电镜下观察的RVA颗粒；E为毒株RVA/Bat-tc/CHN/CHYNC82/2016/G3P[3]的PAGE分析。图4 CHYNC82感染的细胞培养及在电镜下观察到的典型RVA颗粒Fig.4 Cell culture of CHYNC82 infection and typical RVA particles observed under an electron microscope

将CHYNC82病毒株接种至MA104细胞后，每12 h收取细胞培养液上清测定病毒生长动力学，使用TaqMan real-time qPCR进行病毒定量。结果表明病毒由12 h的4×103copies/μL增殖至60 h的3×106copies/μL(图5)。

图5 CHYNC82毒株的生长动力学Fig.5 Growth kinetics of the CHYNC82 strain

为观察该毒株的形态学，收取MA104细胞感染的第3代细胞培养液进行电镜观察，可见典型的轮状病毒颗粒(图4B、D)。从MA104细胞培养物中提取该病毒RNA，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和银染，结果发现该病毒具有A组轮状病毒典型的4-2-3-2基因迁移模式(图4E)。

3 讨 论

轮状病毒是重要的胃肠道病原体，主要通过粪口途经传播，是引起全世界婴幼儿急性重症胃肠炎和腹泻的主要原因，目前尚无特效治疗药物[1]。轮状病毒是一类人兽共患病原体，其中A组轮状病毒具有广泛的宿主分布，可以感染包括人类和许多动物的幼崽，包括马、猫、狗、猴子、老鼠、牛、猪、蝙蝠和鸟类等[10]。据报道，2010年在肯尼亚的果蝠中首次发现蝙蝠轮状病毒，该病毒与已知病毒差别较大[11]。此后，我国科学家在云南蝙蝠中发现1株重配株MSLH14，而且证实该病毒能够跨种传播，且可能经历了多次重配[10]。迄今为止，已检测并报告了超过20种蝙蝠RVA株，至少存在7种不同的基因型[7],其中重配在基因多样性中扮演重要角色。在本研究中，我们从中国云南省的1只中华菊头蝠的肠道组织中分离了1株RVA毒株，并对该病毒的进化关系进行了研究。

对该病毒11个节段的序列分析发现，CHYNC82的VP1、NSP2、NSP3和NSP4与蝙蝠RVA的MYAS33和MSLH14株同源性最高且聚为一支，MYAS33株具有罕见的P[10]基因型[12]。CHYNC82的VP6和NSP1与已知病毒同源性较低，仅为83.3%和87.9%，但与蝙蝠和人来源轮状病毒具有共同进化起源，而CHYNC82的VP2与人09US7118株和猿猴TUCH株亲缘关系最为相近。研究指出，人09US7118株是一株猿猴来源并通过跨种传播而感染人类的[13]。猿猴TUCH株被认为是由人和不明来源的基因重配而产生的非典型猿猴RVA毒株，且其VP2基因被认为与人DS-1样轮状病毒起源于共同祖先[14]。

值得注意的是，CHYNC82的VP7、VP4、VP3和NSP5均与人类病毒株，包括CMH222株和MS2015-1-0001株具有最近的亲缘关系。研究指出，CMH222株被认为是山羊GRV株和猿猴RRV株跨种传播后基因重配产生[15]，而CHYNC82的VP4基因与山羊GRV株也处于同一进化树枝，同源性仅次于CMH222，且GRV也属于G3P[3]基因型，而MS2015-1-0001的每一个基因节段都似乎起源于蝙蝠，可能是由蝙蝠直接向人类进行种间传播[16]。上述结果提示CHYNC82可能已发生跨种传播到人和猿猴，亦或可能是由人、猿猴、蝙蝠来源或跨种的RVA多重重配产生的重配株。CHYNC82的多个节段与不同宿主来源的轮状病毒均有高度同源性，这类现象可能是由于跨种传播产生，但也可能是由于趋同进化产生。而本研究中最为相近的宿主来源主要为人、猿猴和蝙蝠，因此更趋于跨种传播后的重组导致。

轮状病毒VP4刺突蛋白在感染过程中，首先要将VP4蛋白通过胰酶作用切割为VP5*和VP8*，进而激活轮状病毒的感染，VP8*是与宿主受体结合的关键区域。轮状病毒是否具有跨种传播的能力，与受体的跨种结合能力有关。前期研究表明突变VP8*的重要抗原结合位点可以导致蝙蝠轮状病毒获得人的受体结合能力，而人的第189位氨基酸突变则导致病毒失去受体结合能力，而不发生红细胞凝集[9]。本研究将CHYNC82阳性样品用浓度为15 μg/mL胰蛋白酶进行活化后，接种至MA104细胞。初次传代后细胞出现轻微病变，随着传代次数的增加，病变越来越明显。另外，有研究在Marc145和BFK细胞中也成功分离蝙蝠A组轮状病毒[17]。CHYNC82是否具有感染人类的能力需要近一步的研究确定。

重配的发生有助于轮状病毒的高度遗传多样性。与已知的蝙蝠RVA相比，CHYNC82基因组包含的片段与人和其他哺乳动物RVA病毒株的片段密切相关，这表明CHYNC82可能是因种间传播而产生的一株源自人和其他哺乳动物RVA株的重配RVA株。因此，为了更好地控制和预防人类RVA感染，对动物(包括野生动物)中的RVA进行调查和监测是有必要的，这也有助于我们了解RVA在自然界的进化。

利益冲突：无