山荷复合酵素发酵工艺优化

陈 芳，瞿昊宇，陈俣祯，蒋 星，田 慧，谢梦洲

(1湖南中医药大学，长沙 410208；2湖南省药食同源功能性食品工程技术研究中心，长沙 410208；3中医诊断学湖南省重点实验室，长沙 410208；4湖南中医药大学中医心肺病证辨证与药膳食疗重点研究室，长沙 410208)

酵素是指选取一种或多种新鲜水果、蔬菜、食用菌、中草药为基础原料，经乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多种有益菌发酵而使原材料的生物活性增强或产生新的生物活性物质[1-2]。在中国，至少有41.9%的成年人患有高脂血症[3-4]。关于具有降血脂功能的药食同源中药酵素方面的研究鲜有报道。山楂荷叶复合酵素处方来自湖南中医药大学中医药膳学及药食同源功能性食品研究专家谢梦洲教授创制的药食同源中医药膳方[5]，由山楂、山药、茯苓、荷叶、甘草5味具有降血脂功能的药食同源中药组成[6-8]，前期研究[9]发现，本方发酵前后都有降血糖作用，但发酵前后降血脂的活性成分是否发生改变尚未得知。为阐明发酵前后对降血脂活性成分的影响及发酵的意义，本试验以山楂、荷叶等5味药食同源中药为主要原料，双歧杆菌为发酵菌种，以降血脂活性成分荷叶碱、熊果酸、金丝桃苷为评价指标，HPLC测定荷叶碱、熊果酸、金丝桃苷的含量，通过正交试验优化发酵工艺，95%可信区间重叠法统计分析比较本品发酵前后荷叶碱、熊果酸、金丝桃苷含量的差异，为本品开发成辅助降血脂作用的功能性食品提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 材料与试剂

山楂(批号：191203831)、荷叶(批号：20200510)、甘草(批号：20200105)、山药(批号：191204751)、茯苓(20191226)药材饮片,购自康美药业股份有限公司，经本校药学院王智老师鉴定符合2015版《中国药典》(一部)有关规定；双歧杆菌SC13111121013377,北京川秀科技有限公司。甲醇(99.9%色谱纯HPLC)、乙腈(99.9%色谱纯HPLC)，Tedia Company；甲醇(99.9%质谱纯LC-MS)、乙腈(99.9%质谱纯LC-MS)，OCEANPAK；无水葡萄糖对照品，购于上海沃凯生物技术有限公司(批号：20080415)；试剂均为分析醇。苯酚，广东光华科技股份有限公司(批号：20160701)；硫酸,株洲市星空化玻有限责任公司有限公司(批号：20171120)；乙醇,上海沃凯生物技术有限公司(批号：20180413)；实验室用水为纯化水。

1.2 仪器与设备

GI54DWS高温高压灭菌锅,致微(厦门)仪器有限公司；JFHB-55YT发酵罐,荣华仪器制造有限公司；ZWL-PAI-10超纯水机,湖南中沃水务环保科技；ATX124电子天平型124～0.000 1 g,东京岛津仪器有限公司；KM5200DE超声波清洗器,昆山美美超声仪器；SHH.W21电热三用水箱,北京中兴伟业仪器；U3000液相色谱仪，德国赛默飞；BCD-610W冰箱，(西门子)博西华家用电器有限公司；电热恒温水浴锅DIKW-S-6，北京市永光明医疗仪器；N-3010 10L旋转蒸发器，日本东京理化；SCIENTZ-10N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份；HNYC-203T智能恒温培养振荡器，天津欧诺仪器股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 山楂荷叶复合酵素发酵前样品的制备

取山楂、荷叶、甘草混匀，加入70%乙醇浸泡后回流提取2次，过滤，合并滤液，50 ℃减压浓缩至无醇味；山药、茯苓混匀，加水浸泡提2次，过滤，滤液与醇提浓缩液合并，50 ℃减压浓缩至每mL相当于药材2 g，-80 ℃冰箱保存。

2.2 高效液相色谱法测定山楂荷叶酵素中荷叶碱、金丝桃苷、熊果酸的含量

2.2.1 山楂荷叶酵素供试品溶液的制备 将各山楂荷叶复合酵素样品用0.22 μm有机微孔滤膜过滤，即得各山楂荷叶复合酵素供试液。

2.2.2 荷叶碱、金丝桃苷空白对照溶液的制备 取甲醇溶液，用0.22 μm有机微孔滤膜滤过，即得空白对照液。

2.2.3 荷叶碱、金丝桃苷对照品溶液的制备 取荷叶碱、金丝桃苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成含荷叶碱浓度为17.33 μg/mL、金丝桃苷浓度为21.64 μg/mL的对照品溶液，即得荷叶碱对照液、金丝桃苷对照液。

2.2.4 荷叶碱、金丝桃苷含量测定的色谱条件 采用高效液相色谱法(参考2020版《中国药典》第四部通则0512)测定山楂荷叶酵素中荷叶碱、金丝桃苷含量。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(月旭科技上海股份有限公司，Ultimate XB-C18型色谱柱，5 μm，4.6×250 mm)；以乙腈为流动相A、以甲醇为流动相B、以0.001%磷酸水溶液为流动相C；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；荷叶碱、金丝桃苷检测波长为270 nm。按表1中的设定进行梯度洗脱。

表1 荷叶碱、金丝桃苷色谱测定条件

2.2.5 荷叶碱、金丝桃苷测定方法 分别精密吸取空白对照液、荷叶碱对照液5 μL、金丝桃苷对照液5 μL注入高效液相色谱仪，测定，即得，结果见图1～图5。

图1 空白对照液色谱图

图2 荷叶碱对照液色谱图

图3 金丝桃苷对照液色谱图

图4 复合酵素发酵前荷叶碱、金丝桃苷色谱图

图5 复合酵素发酵后荷叶碱、金丝桃苷色谱图

2.2.6 熊果酸空白对照溶液的制备 同2.2.2。

2.2.7 熊果酸对照品溶液的制备 取熊果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成含熊果酸浓度为430.0 μg/mL的对照品溶液，即得熊果酸对照液。

2.2.8 熊果酸含量测定的色谱条件 采用高效液相色谱法(参考2020版《中国药典》第四部通则0512)测定山楂荷叶复合酵素中熊果酸含量。色谱条件：同2.2.4，熊果酸检测波长为215 nm；按表2中的设定进行梯度洗脱。

表2 熊果酸含量测定色谱条件

2.2.9 熊果酸测定方法 精密吸取上述空白对照液、熊果酸对照液山楂荷叶酵素供试液各20 μL、注入高效液相色谱仪，测定，即得，结果见图6～图8。

图6 熊果酸对照液色谱图

图7 山楂荷叶复合酵素发酵前熊果酸色谱图

图8 山楂荷叶复合酵素发酵后熊果酸色谱图

2.3 山楂荷叶复合酵素发酵工艺优化

2.3.1 山楂荷叶复合酵素发酵基本工艺 将2.1中山楂、荷叶等5味中药浓缩液解冻，置高压灭菌锅中，121 ℃，灭菌20 min，置无菌室内，分成9份，每份200 mL，按表3设计加入一定量的双歧杆菌菌粉，按一定温度、时间、转速为180 r/min条件下进行发酵，将发酵液于50 ℃、30 r/min、30 hPa条件下减压浓缩至药材：浓缩液=2∶1，再冷冻干燥成干浸膏粉，测定荷叶碱、熊果酸、金丝桃苷含量。

2.3.2 山楂、荷叶复合酵素的发酵工艺正交设计试验 选取对发酵工艺影响较大的接种量、发酵温度、发酵时间等3个因素进行考察，每个因素取3个水平，HPLC测定山楂荷叶复合酵素中荷叶碱、金丝桃苷、熊果酸含量，发酵工艺因素水平见表3、正交设计安排见表4、因素间方差分析见表5、对因素间有统计意义则进行水平间方差分析见表6。以荷叶碱百分含量为评价指标：C因素应取3水平，即发酵时间72 h；A、B因素水平可任意取值。以熊果酸百分含量为评价指标：C因素应取3水平，即发酵时间72 h；A、B因素水平可取任意值,考虑经济效益，取A、B因素皆为1水平，即接种量5%、发酵温度31 ℃。综上所述，山楂、荷叶复合酵素的最优发酵工艺是接种量为发酵液体积的5%、发酵温度31 ℃、发酵时间72 h。

表3 山楂、荷叶复合酵素的发酵工艺因素水平

表4 发酵工艺正交设计试验荷叶碱、金丝桃苷、熊果酸测定结果

表5 发酵工艺正交设计试验荷叶碱、熊果酸、金丝桃苷因素间方差分析表

表6 发酵工艺正交设计试验荷叶碱、熊果酸水平间方差分析

2.3.3 山楂荷叶复合酵素发酵工艺验证试验结果 取山楂、荷叶等5味药食同源中药三批(批号为：20210322、20210326、20210330)，每批1.0 kg，按2.1法制备浓缩液，加入菌粉量为浓缩液体积的5%，在31 ℃、转速为180 r/min的条件下发酵72 h，将发酵液于50 ℃、30 r/min，30 hPa条件下减压浓缩至药材：浓缩液=2∶1，再冷冻干燥成干浸膏粉，发酵工艺验证结果接近正交设计试验安排表中的最高值，表明此工艺科学、合理、稳定、可行。

2.3.4 山楂荷叶复合酵素发酵前后荷叶碱、熊果酸、金丝桃苷含量对比分析 将山楂荷叶复合酵素发酵前的浓缩液(药材∶浓缩液=2∶1)冷冻干燥成干浸膏粉，测得荷叶碱、熊果酸、金丝桃苷含量，与发酵后样品(发酵工艺验证样品)含量进行对比分析。由表7可知，山楂荷叶复合酵素发酵前后各降血脂活性成分含量的95%可信区间未重叠，差别有统计意义，发酵后样品中荷叶碱含量是发酵前样品中荷叶碱含量的2.031倍。发酵后样品中金丝桃苷的含量是发酵前样品中金丝桃苷含量的2.014倍。发酵后样品中熊果酸含量是发酵前样品中熊果酸含量的3.137倍。

表7 山楂荷叶复合酵素发酵前后各降血脂活性成分测定结果及95%可信区间

3 结论与讨论

双歧杆菌作为有益的微生物[10-11]，被制成菌粉广泛应用于食品、保健品和药品等领域，具有安全无毒、发酵工艺成熟、便于掌握的特点，且发酵后的含量明显增加，说明功能成分含量和菌种有很大关系。本试验选用双歧杆菌作为发酵菌种，由于双歧杆菌产品说明书中对发酵温度、发酵时间、加菌量尚未明确说明，且说明书中给出的使用参数范围太宽、不具体、不可控，为了得到最佳发酵参数，故需进行发酵工艺优化，使发酵产品达到最优功效。本试验以荷叶碱、熊果酸、金丝桃苷为评价指标，利用双歧杆菌进行发酵。通过对复合酵素发酵工艺进行优化，得到了复合酵素发酵工艺条件：接种量为待发酵液体积的5%、发酵温度为31 ℃、发酵时间为72 h。在此优化的发酵工艺条件下，山楂荷叶复合酵素样品中荷叶碱含量为0.045 1%、熊果酸含量高达3.630 9%、金丝桃苷含量高达0.042 3%。本研究发现，通过双歧杆菌发酵制作的复合酵素中降血脂活性成分荷叶碱、熊果酸、金丝桃苷含量比发酵前显著增加，意味着增强了本品降血脂的功能，为将本品开发成具有辅助降血脂功能的保健食品提供理论依据。

目前，“药食同源”酵素改善机体降血脂功能的评价指标较单一，缺乏相关调控信号通路和作用机制的研究，且“药食同源”酵素多为复方配伍，其作用途径和作用靶点并非单一而是多靶点结合。因此，在今后的研究中还应寻求关键作用靶点以及不同靶点之间的协同作用，同时也可以利用液相色谱、气相色谱和核磁共振等技术分析“药食同源”酵素中活性物质的分离纯化和结构鉴定，进一步明确有效功能因子。