青花椒果壳渣生物发酵产物滤液抗衰老功效探究

束成杰，张锋伦，赵孔发，李卓航，冯志营，傅 雷，郑 丹，张卫明*

（1.南京野生植物综合利用研究所，江苏 南京 211111；2.江苏省天然香料工程技术中心，江苏 南京 211111；3.昭通市大成农业开发有限责任公司，云南 昭通 6571004；4.南京师范大学泰州学院，江苏 泰州 225300）

青花椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc.），芸香科花椒属植物，因其果实成熟后为青色而得名，主要分布于我国云南、贵州、四川等地［1］。青花椒作为调味料和中药使用历史悠久［2］。现代研究显示，花椒属植物的化学成分主要包括生物碱、酰胺、木质素、挥发油、香豆素、黄酮类和脂肪酸等［3-4］，有镇痛、麻醉、抑菌、抗肿瘤等药理活性，对心血管系统、消化系统、免疫机能都有重要的作用，在食品、医药、农业和日化行业中具有巨大的应用潜力［5-6］。

现代生物发酵技术是在继承中药炮制学中发酵法的基础上，吸取微生态学研究成果，结合现代微生物工程而形成的高科技中药制药新技术。通过微生物发酵工艺制备天然产物发酵物，可以酶解药材细胞壁结构，更充分的释放天然产物的有效成分，提高其利用率［7-8］。

目前，青花椒利用成分以精油为主，在萃取精油后，青花椒果壳渣被作为废弃物处理。然而对其研究和开发利用甚少，其功效尚也未见报道。本试验通过生物发酵的工艺对青花椒果壳渣进行生物发酵，得到青花椒果壳发酵产物滤液，基于模式动物秀丽线虫探究青花椒果壳渣发酵产物滤液的功效探究，为青花椒资源的综合开发以及高值利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料原料

青花椒果壳渣，青花椒果实由昭通市大成农业开发有限责任公司提供，南京野生植物综合利用研究所充分提取精油后，自然晾干即得；

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）购自安琪酵母股份有限公司，

野生型秀丽线虫N2由秀丽线虫遗传中心提供。

1.2 仪器设备

MQT-60R 摇床（上海旻泉有限公司）；LDZX-50KBS 高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；SPX-150B-Z 生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；JW-25017HR 高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）；Olympus-BX41 奥林巴斯显微镜（南京艾朗仪器有限公司）；DS-1组织粉碎机（北京华欣科创科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 酿酒酵母种子液制备方法

麦芽汁培养基在121℃，0.1 MPa 条件下灭菌20 min 后，接种酿酒酵母菌，设置培养温度为28℃，摇床转速为120 r/min，培养24 h；使菌体浓度达到108CFU/mL。

1.3.2 青花椒果渣生物发酵工艺

精确称取青花椒果壳渣，粉碎过120目筛，按料液比1：10（g/mL）加入无菌去离子水，并调节pH 为6.0～6.5；按照5‰投料比例接种酿酒酵母种子液，充分搅拌均匀，35℃发酵72h，8 000 r/min 离心15min，取上清液在1200 Bar 条件下完成破壁，冷却后过0.45μm 微孔滤膜［9］，得青花椒果壳渣发酵产物滤液（Ferment filtrate ofZ.schinifolium，FFZ）。

1.3.3 秀丽线虫同步化

秀丽线虫体内出现大量虫卵时，缓冲液洗脱收集至离心管中，加入1mL 裂解液（10%次氯酸：1 mol/L 氢氧化钠=1：1），4 000 r/min，离心1min；去除裂解液，用缓冲液洗涤3次，将底层的虫卵用移液器吸出，涂在含有大肠杆菌OP50 的培养基上，20℃培养48～60 h，得年轻成虫［10-11］。

1.3.4 FFZ对秀丽线虫寿命的影响

将FFZ 用缓冲液稀释成1%、2%、4%三个浓度，分别暴露年轻成虫6h（保证线虫食物充足）。线虫寿命检测方法参照已有文献的报道［12-13］。雌雄同体的线虫每天换一次培养皿。每一处理取40 条线虫进行寿命测试。收取曲线代表三次实验的结果。

1.3.5 FFZ对秀丽线虫运动行为的影响

运动行为测试中，取头部摆动和身体弯曲这两项指标进行测试。测试方法参考之前的文献报道［14-15］。头部摆动定义为线虫弯曲半个身体，从一侧转到另一侧的改变。测试时间为1min。身体弯曲定义为假设线虫运动方向为X 轴方向，那么灯泡状第二咽泵呈Y 轴方向，即一个身体弯曲。每一处理取20条线虫进行测试。实验重复三次。

1.3.6 FFZ对秀丽线虫吞咽频率的影响

随机挑取20 条暴露后的秀丽线虫，在奥林巴斯高倍显微镜下，观察并记录1min 内秀丽线虫的吞咽次数，作为秀丽线虫吞咽频率的指标，实验重复三次［16-17］。

1.3.7 FFZ对秀丽线虫排泄周期的影响

单独的线虫被取出检测。当线虫体壁肌肉伸缩排泄到下一次体壁伸缩排泄的周期时间极为排泄周期。这一实验需在高倍显微镜下观察。30 条线虫为一组，实验重复三次［18］。

1.3.8 FFZ对秀丽线虫热激反应的影响

将暴露后的秀丽线虫放置35℃条件下培养6 h，然后随机挑取30条秀丽线虫，20℃培养，每组设3个平行。根据秀丽线虫生存的条数绘制曲线，实验重复三次［19］。

1.3.9 FFZ对秀丽线虫肠道活性氧水平的影响

秀丽线虫肠道内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平分析参考文献［20-21］方法采用荧光探针DCFH-DA（2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐）检测秀丽线虫体内的氧自由基水平。每个浓度处理50 条线虫，实验重复三次。

2 结果与分析

2.1 FFZ对秀丽线虫寿命的影响

实验发现，1%，2%和4%的FFZ 能够延长线虫的寿命，其中2%和4% FFZ 的影响显著，而浓度为8%时，FFZ 对线虫的寿命影响不显著，与对照相当（图1-A）。从线虫平均寿命来看（图1-B），2%FFZ可以将线虫寿命从19.33 天延长22.33 天，4%FFZ 可以将线虫寿命从19.33 天延长至24.67 天。然而8%FFZ 处理以后，线虫的寿命与对照相当。因此，一定浓度的FFZ 能够促进线虫机体细胞健康活跃，维持良好的生长发育状态，延缓衰老。

图1 FFZ对线虫寿命的影响Fig.1 Effects of FFZ treatment on lifespan of nematodes

运动行为能力以头部摆动和身体弯曲为终点评价指标，可以为秀丽线虫的生长发育状况提供评价参考。本试验中，2%和4%的FFZ 能够显著性地提高头部摆动与身体弯曲能力（图2A，B），线虫活跃度提高。因此，2%和4%的FFZ 能显著提高秀丽线虫运动能力，减缓机体衰老。

图2 FFZ对线虫头部摆动（A）和身体弯曲（B）的影响Fig.2 Effects of FFZ treatment on head thrash（A）and body bend（B）of nematodes

咽泵运动能够反映秀丽线虫摄取食物能力，摄食能力强可反应由反应秀丽线虫机体健康水平。如图3所示，与对照组相比，1%，2%的FFZ对秀丽线虫的咽泵运动未出现显著影响，当FFZ 浓度为4%时，咽泵运动频率显著增加，然而浓度为8%时，咽泵运动能力与对照相当。由此可见，4%FFZ 能够通过提高摄食能力，维持线虫良好状态。

图3 FFZ对咽泵运动的影响Fig.3 Effects of FFZ treatment on pumping rates of nematodes

排泄周期是评价秀丽线虫抗氧化的重要指标，秀丽线虫生长及生命状态越好，其细胞代谢能力越强，排泄周期越短。如图4所示，与对照组相比，FFZ 处理秀丽线虫，代谢能力1%～8%的FFZ 能够提高秀丽线虫代谢能力，提高秀丽线虫有机体抗氧化水平，其中2%，4%FFZ 处理秀丽线虫，排泄周期显著缩短，代谢加快，机体抗氧化水平提高。

图4 FFZ对排泄周期的影响Fig.4 Effects of FFZ treatment on defecation of nematodes

内源性ROS 是含氧的化学物质，是氧正常代谢的天然副产物，在细胞信号传导和体内平衡中具有重要的作用。然而，当其水平超过了细胞抗氧化能力时，就会引发一系列细胞反应，造成细胞严重且广泛的氧化。ROS 水平急剧增加，可能会对细胞结构造成严重损害，这就被称为氧化应激。荧光探针DCFH-DA 能够与肠道内ROS 结合，在激发光下呈现绿色荧光。通过软件换算成表达量，如图5所示，4%FFZ 处理秀丽线虫后，肠道ROS 的绿色荧光表达显著性下降，表明肠道内ROS 显著减少，机体抗氧化水平显著提高。

图5 FFZ对线虫肠道ROS表达量的影响Fig.5 Effects of FFZ treatment on intestinal ROS production of nematodes

热应激效应能引起细胞的氧化应激，导致机体组织细胞内氧化代谢产物增加，氧自由基、过氧化物含量增高，抗氧化酶分解氧化物速度很难跟上氧化代谢反应的速度，严重影响了机体正常的生理代谢，发生组织损伤［22］。热激以后，秀丽线虫的寿命出现显著性的缩短，从正常寿命20±1 天缩短至14.33 天，而1%～8%FFZ 均能够延长秀丽线虫热激后的寿命，2%，4%，8%的FFZ 效果显著，8%的FFZ由于浓度高，可能引起机体在物理渗透等方面存在压力，效果劣于其他浓度。由此说明，合适浓度的FFZ 能够减少热激导致的机体损伤，提高抗氧化能力。

图6 FFZ对线虫热激后的寿命的影响Fig.6 Effects of FFZ treatment on lifespan after heating stress of nematodes

4 结论与展望

青花椒作为中国传统中药，已被应用多年。青花椒精油具有除螨抑菌功效，花椒生物碱已被证明具有多种药理作用，包括抗菌作用、抗炎作用以及血脂调节作用。本研究从生物发酵的角度综合开发利用青花椒果壳渣，探究了发酵产物的功能。借助模式动物秀丽线虫探究了发酵产物的体内功效，实验结果表明，青花椒果壳渣在酿酒酵母的作用下产生的发酵产物滤液具有良好的抗氧化功效。可为青花椒资源的充分开发利用提供理论参考。

生物发酵产品因其显著的产品功效、良好的肤感、安全无毒、低刺激，并且成分更加简单和天然，在美白、保湿、抗衰老等日化应用方面都有很好的应用潜力。目前，生物发酵过程中植物或者中药材间相互作用机理的研究还比较欠缺，并且能够应用到中药微生物发酵制品中的中药单方、复方也较少，还需将中医理论进一步地与现代发酵技术进行结合。目前对发酵过程中微生物与植物或者中药材之间的作用较多地停留在体外功效和活性物质的研究上，随着皮肤微生态研究领域的发展，还需要进一步考虑发酵产物对人体皮肤微生态的影响。尽管植物发酵技术在应用中也存在着各种问题，但随着相关理论和技术的不断深入和完善，植物生物发酵技术会在化妆品中有更光明的应用前景。