桔青霉引起透明丝孢霉病1例及文献总结

石海燕 陈美 张丽 孙毅 曾同祥 柳兵 张秋秋

(1.长江大学第二临床医学院皮肤科，荆州 434100; 2.长江大学第二临床医学院骨关节科，荆州 434100)

青霉菌属(Penicillium)在我们的生活环境中虽无处不在，但极少引起人类疾病[1]。我科发现1例以单发皮肤斑块、结节，少许破溃、结痂为表现的患者。经荧光镜检、组织病理、活检组织培养菌落菌种及来自蜡块组织的分子鉴定，最终确诊为桔青霉引起的透明丝孢霉病，汇报如下。

1 临床资料

1.1 临床病史

患者，女，55岁，因左手前臂处斑块结节4个月余来我院门诊就诊。4个月余前患者无明显诱因左手前臂处出现绿豆大小暗红色斑块，后逐渐增大，出现破溃、结痂。在此期间曾至多家医院就诊，按“湿疹”治疗，未见明显疗效。偶伴瘙痒、疼痛不适。既往无特殊病史，未饲养宠物。体检检查：生命体征平稳，系统查体未见特殊。皮肤科专科检查：左手前臂处可见大小约1 cm×3 cm暗红色斑块、结节，少许破溃、结痂(见图1A)。真菌镜检：取皮肤表面组织直接显微镜下荧光染色，可见少许荧光染色阳性的菌丝(见图2A)；手术取活检组织，同时病理检查、细菌培养及真菌培养。

1.2 组织病理

镜下见被覆鳞状上皮增生，上皮脚延长，真皮内及血管周围大量中性粒细胞浸润、淋巴细胞及组织细胞，少许嗜酸性粒细胞，个别多核巨细胞吞噬异物，10倍镜下HE染色可见清晰的菌丝样成分；4倍镜及10倍镜下的PAS染色可见大量真菌菌丝，偶见分枝状(见图3)。

1.3 菌种鉴定

源自活检组织培养后的真菌DNA提取及测序 取活检组织接种于沙堡弱葡萄糖琼脂培养基(SDA，含卡那霉素100 μg/mL)中，放置28℃培养箱中培养7 d，挑取长出的菌落接种至SDA培养基中培养7 d，进行形态学观察：观察菌落形态，考虑青霉属真菌(见图2B)；同时利用Omega D3390-02 Fungal DNA Kit真菌DNA小量提取试剂盒(北京杰辉博高生物技术有限公司)提取DNA，利用引物ITS1和ITS4对其真菌DNA的ITS区进行扩增，扩增体系如下：反应体系50 μL，模板DNA 11 μL，上下游引物各2 μL，2×Hieff©PCR Master MIX 25 μL,添加灭菌注射用水补足至50 μL；反应条件为：94℃预变性4 min 30 s,94℃变性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 共30个循环，后72℃延伸10 min。将扩增的PCR产物送至上海生工武汉分公司测序，测序结果登录NCBI(National Center for Biotechnology Information)进行Blast比对，结果与桔青霉(P.citrinumstrain SCSAAF0015)的DNA序列一致度为99%(见图4)。

源自福尔马林固定后石蜡包埋的组织(FFPE)DNA提取鉴定 将蜡块标本连续切片处理后，置于1.5 mL的无菌EP管中；采用QIAamp©DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen；Hilden，德国)提取总DNA。选用真菌通用引物12F和13R对上述所提取DNA进行扩增[2]，扩增体系如下：反应体系为25 μL，模板DNA 100 ng，上下游引物各1 μL，金牌MIX补足至25 μL；反应条件为：98℃预变性4 min,98℃变性1 min，退火52℃ 1 min，延伸72℃ 1 min 共40个循环，后延伸72℃ 2 min。将扩增的PCR产物送至天一辉远有限公司测序。测序所得结果确为桔青霉(P.citrinum)(见图5)，与病变组织培养出来的真菌测序比对结果一致。

1.4 药物敏感性试验

参考美国临床实验室标准研究所(CLSI)M38-A2方案[3]，配制RPMI 1 640液体培养基，过滤灭菌后备用。近平滑念珠菌(ATCC22019)作为本试验的质控菌株。将受试桔青霉接种至SDA培养基上，放置35℃温箱培养3 d后收集孢子重悬于用生理盐水中，再用血细胞计数板调整孢子量为(2～4)×106CFU/mL；然后用RPMI 1 640液体培养基将调整好的菌悬液稀释100倍使其终浓度为(2～4)×104CFU/mL。将所用的实验药物伊曲康唑倍比稀释成2倍于终浓度后加入96孔板中，药物浓度范围为0.03～4 μg/mL，每孔加入100 μL，再加入100 μL稀释后的菌悬液。H1孔为生长对照(无药物孔)和H10孔为空白对照(无菌孔)。放置35℃温箱孵育48 h。然后肉眼观察判读结果，最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)读取肉眼观察到的真菌生长100%受抑制的最低药物浓度。

1.5 诊断与治疗

诊断 桔青霉所致的透明丝胞霉病。经分子生物学及形态学鉴定，分离菌种鉴定为桔青霉。

治疗 微量液基稀释法测得伊曲康唑对此桔青霉的MIC值为0.5 μg/mL。根据临床经验及实验结果抗真菌治疗予伊曲康唑200 mg/d口服治疗。治疗1个月后复诊，皮疹较前明显好转，皮疹范围明显缩小，斑块结节变小，破溃糜烂面愈合(见图1B)。

2 讨 论

桔青霉(P.citrinum)极少引起人类感染，属于一种条件致病菌[4]，可引起角膜炎、皮肤感染、肺炎。在我们的病例中，患者皮损处的皮屑直接荧光镜检阳性，手术取得活检组织切除后进行组织病理检查提示真菌感染，与此同时发现活检组织培养阳性，我们提取了来自活检组织培养后的真菌DNA，并对其DNA进行扩增并送测序，测序结果提示桔青霉，为进一步明确菌种，我们又对蜡块组织的真菌DNA进行了分子生物学鉴定(由北京大学第一医院皮肤科宋营改博士辅助完成)，比对了来自活检组织培养出来的真菌DNA和来自蜡块组织的真菌DNA序列，发现两者的结果均为桔青霉，最终确诊为桔青霉所致的透明丝胞霉病，可排除实验室污染的可能。我们检索到6例人类桔青霉感染的报道，均发生在免疫受损的患者，其中4例引起严重的肺部疾病[5-7]，1例在白内障术后导致眼内炎[8]，另1例在急性白血病患儿导致皮肤的感染[9]。均通过微生物学及组织病理学确诊。其中3例均发生在接受强化化疗的白血病患者中，肺部感染患者在接受甲强龙抗炎治疗的同时给予抗真菌药物(两性霉素B、卡泊芬净、氟康唑、泊沙康唑或伊曲康唑)治疗。导致眼内炎的患者玻璃体腔内注射两性霉素B，口服氟康唑，但最终疗效欠佳摘除眼球；而在我们的病例中，患者自述既往无特殊病史，门诊检查血糖值正常，且未发现患者有其他免疫系统受损疾病，因此笔者推测可能由外伤引起的真菌感染。虽然针对桔青霉引起的透明丝孢霉病目前国际上没有标准的诊疗指南，但是根据美国德克萨斯大学健康科学中心(University of Texas Health Science Center at Houston)的真菌检测实验室对10株桔青霉抗真菌药物敏感性试验报告，两性霉素B MIC≤1 μg/mL，卡泊芬净MIC≤0.125 μg/mL，米卡芬净MIC≤0.25 μg/mL，伊曲康唑MIC≤4 μg/mL，泊沙康唑为MIC≤2 μg/mL，伏立康唑MIC>16 μg/mL[10]，伏立康唑的最低抑制浓度很高(MIC>16 μg/mL)，而其他三唑类和其他类型的抗真菌剂的MIC均小于或等于4 μg/mL，因此伏立康唑不能作为桔青霉感染抗真菌治疗的一线用药。另外有研究证实两性霉素B和伊曲康唑常用于治疗青霉菌感染引起的真菌病，但因两性霉素B不良反应较大、成本较高等弊端，大多情况下我们用广谱抗真菌药伊曲康唑代替两性霉素B治疗[11]。因此我们在对其进行分子鉴定的同时根据病理及传统的真菌学检查结果给予伊曲康唑200 mg/d口服治疗1个月后，患者病情取得良好的改善。

致 谢

感谢北京大学第一医院李若瑜教授对本例患者诊治过程中给予的帮助和指导。