淡豆豉发酵过程总黄酮和多糖含量动态分析*

刘 锋，曹冬英，徐 伟，隋利强

（1.福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004；2.福建中医药大学药学院/福建省中药制剂与质量控制工程技术研究中心，福建 福州 350122）

淡豆豉以黑豆为原料，桑叶、青蒿为辅料，经过微生物的转化发酵而来，具有解表除烦、宣发郁热的功效[1]。淡豆豉中含有多糖、黄酮、氨基酸等有效活性成分，其中多糖具有抗氧化、降血糖等药理作用[2-3]，黄酮具有解热、降血脂、抗肿瘤及抗动脉硬化等药理作用[4-7]。淡豆豉发酵过程，多糖和黄酮类成分随着微生物代谢发生转化，并随着发酵进展含量呈动态变化。为进一步明确淡豆豉发酵过程多糖和黄酮类成分的变化，本研究收集了淡豆豉发酵第2、4、6、13天及闷制第3、9、15天的样品，测定其总黄酮和多糖的含量，分析淡豆豉在发酵不同阶段总黄酮及多糖含量的动态变化。

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器 SP-1920型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；Q-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SQP型十万分之一分析天平[赛多利斯科学仪（北京）有限公司]；R-1001VN型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；TC-M600D型低速台式空冷型离心机（宁波拓普森科学仪器有限公司）；HH-ZK4型恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 材料与试剂 黑豆（市售）经福建中医药大学车苏容副教授鉴定为豆科植物大豆[Glycine max（Linn.）Merr.]的成熟种子；桑叶（北京本草方源药业集团有限公司，批号：20170508）经福建中医药大学车苏容副教授鉴定为桑科植物桑（Morus alba L.）]的叶；青蒿（安徽顺和堂中药饮片有限公司，批号：171201）经福建中医药大学车苏容副教授鉴定为菊科植物黄花蒿（Artemisia annua Linn.）的干燥地上部分。染料木苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：3W87E685）；D-无水葡萄糖对照品（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C11653106）；甲醇、乙醇、苯酚、浓硫酸、氯仿、正丁醇均为分析纯；水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的含量测定[8]

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取染料木苷对照品1.11 mg，用70%甲醇溶解至25 mL容量瓶，定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.044 mg/mL的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取淡豆豉粉末1 g（过40目筛），置三角锥形瓶中，用70%甲醇25 mL加热回流2次，每次0.5 h，放至室温称量，补足失重，摇匀滤过，合并续滤液，取续滤液0.5 mL置25 mL容量瓶中，用70%甲醇定容到刻度，即得。

2.1.3 检测波长的确定 以甲醇为空白对照，将染料木苷对照品溶液和淡豆豉采用药典法闷至15 d的供试品溶液在200～400 nm波长处进行扫描。结果确定两者在260 nm处有最大吸收，故确定260 nm为检测波长。（见图1～2）

图1 染料木苷对照品溶液紫外扫描光谱图

图2 供试品溶液紫外扫描光谱图

2.1.4 线性关系考察 分别吸取对照品溶液0.2、0.6、0.8、1.0、1.5、1.8、2.0 mL置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用紫外分光光度计测定260 nm处吸收，以吸光度值Y为纵坐标，染料木苷浓度X（mg/mL）为横坐标，得到线性回归方程：Y=9.973X+0.047，r=0.999 7，表明染料木苷在0.008～0.090 mg/mL质量浓度范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 吸取对照品溶液1 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.1.4”项下方法连续测定6次，RSD为0.21%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 吸取“2.1.2”项下淡豆豉提取溶液0.5 mL，至25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，按“2.1.4”项下方法分别在0、2、4、8、12 h内测定吸光度值，RSD为1.91%，表明供试品在12 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 取淡豆豉粉末6份，分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1.4”项下的方法进行测定，样品中总黄酮的平均含量为110.37 mg/g，RSD为0.31%（n=6），表明该方法的重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 分别取淡豆豉样品6份，精密加入等量对照品，按“2.1.2”项下方法制备样品，并测定其吸光度，计算样品回收率，结果见表1。

表1 总黄酮加样回收率试验结果 （n=6）

2.1.9 样品总黄酮的含量测定 分别取淡豆鼓发酵第2、4、6、13天和闷制第3、9、15天的样品，按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制备样品溶液，按“2.1.4”项下测定方法进行测定，测得淡豆豉总黄酮含量见表2。

表2 淡豆豉总黄酮含量 （n=3）

2.2 多糖的含量测定

2.2.1 线性关系考察 精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖对照品11.5 mg，加水溶解定容至100 mL，摇匀，即得质量浓度为0.115 mg/mL对照品溶液。精密吸取葡萄糖对照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，加蒸馏水补至总体积1 mL，加入5%的苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入5 mL浓硫酸，立即摇匀，沸水浴15 min，冰水浴15 min，485 nm处测定吸光度。以D-无水葡萄糖的质量浓度（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=8.055 2X+0.026 1，r=0.997 1，表明D-无水葡萄糖的质量浓度在0.012～0.119 mg/mL范围内与吸光度值呈良好的线性关系。

2.2.2 供试品溶液的制备[9-10]精密测定淡豆豉粉末（过40目筛）4 g，采用回流水提多糖，12倍量水提取2次，每次0.5 h，合并提取液，抽滤。加入1/5 Sevag试剂去除提取液，震摇15 min，4 000 r/min离心15 min，取上清液。将除去蛋白后的提取液浓缩至25 mL，加入无水乙醇使含醇量达到80%，静置24 h，离心，收集沉淀，干燥，即得淡豆豉多糖。将干燥后淡豆豉多糖用水溶解并定容至100 mL，即得供试品溶液。

2.2.3 检测波长的确定 以水为空白对照，将葡萄糖对照品溶液和淡豆豉药典法闷至15 d的供试品溶液显色后在400～800 nm波长处进行扫描。结果确定两者在485 nm处有最大吸收，故确定485 nm为检测波长。（见图3～4）

图3 葡萄糖对照品溶液扫描光谱图

图4 供试品溶液扫描光谱图

2.2.4 苯酚-硫酸法测定多糖含量[11-14]精密量取供试品溶液1 mL定容至10 mL容量瓶，定容得待测样品溶液。精密量取1 mL待测样品溶液置具塞试管中，加入5%苯酚水溶液1 mL后迅速加浓硫酸5 mL，摇匀，沸水反应15 min后，冰水浴15 min终止反应，以水为空白对照同法显色，在485 nm处测定。

2.2.5 精密度试验 以吸光值计算，吸取对照品溶液适量，按“2.2.1”项下方法连续测定6次，RSD为0.12%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取淡豆豉溶液适量，按“2.2.1”项下方法分别于0、0.5、1.0、2.0、4.0 h时，测定其吸光值，RSD为1.23%，表明供试品在4 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取淡豆豉粉末6份，分别按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下的方法进行测定，样品中多糖的平均含量为173.09 mg/g，RSD为0.14%（n=6），表明该方法的重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 分别取淡豆豉样品6份，精密加入等量对照品，按“2.2.2”项下方法制备样品，并测定其吸光度，计算样品回收率，结果见表3。

表3 多糖加样回收率试验结果 （n=6）

2.2.9 样品多糖的含量测定 分别取淡豆鼓发酵第2、4、6、13天和闷制第3、9、15天的样品，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法样品溶液，按“2.2.1”项下测定方法进行测定，测得淡豆豉多糖含量见表4。

表4 淡豆豉多糖的含量 （n=3）

3 讨 论

3.1 淡豆豉发酵过程中多糖的动态分析 淡豆豉多糖含量在发酵2～4 d时逐渐升高，在4～6 d时呈下降趋势，在6～13 d时呈上升趋势，发酵13 d时，达到最高值；淡豆鼓多糖在闷制1～3 d呈明显下降趋势，在闷制第3～15 d时呈上升趋势，闷制15 d时达到最高值，与发酵13 d时的多糖含量接近。多糖含量动态变化见图5。由此可知，淡豆豉发酵过程的闷制环节对多糖含量影响不明显。

图5 多糖含量变化动态图

3.2 淡豆豉发酵过程中总黄酮的动态分析 淡豆豉总黄酮含量在发酵2～6 d时逐渐升高，在6～13 d时呈下降趋势，闷制过程随着时间累积呈上升趋势，闷制15 d时达到峰值。总黄酮含量动态变化见图6。此由可知，淡豆豉发酵过程的闷制环节对总黄酮含量影响较大，淡豆豉发酵过程的闷制环节有利于总黄酮的累积。

图6 总黄酮含量变化动态图

3.3 对照品的选择 经查阅文献，淡豆豉总黄酮含量测定可用染料木素和染料木苷[15,8]作为对照品，本研究经过分析选定染料木苷作为测定总黄酮的对照品。结果显示，该方法简便、稳定、可行。

3.4 淡豆豉多糖含量测定方法的选择 经查阅文献，多糖含量测定的显色方法有蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法[12]。预实验过程中对两种方法进行了比较，结果显示，苯酚-硫酸法较蒽酮-硫酸法稳定，故本实验采用苯酚-硫酸法进行显色测定。

3.5 淡豆豉多糖含量测定过程中除蛋白方法的选择 淡豆豉中含有大量的蛋白质，影响淡豆豉多糖的组成及化学结构分析，也影响其生物活性的研究。因此，本研究对淡豆豉多糖进行了脱蛋白研究，以提高其纯度。经查阅文献[12]，提取多糖时有多种除淡豆豉蛋白的方法，预实验比较了sevag法和三氯乙酸法去除淡豆豉蛋白质的效果，结合实验室的实验条件，sevag法操作简便，更适用于淡豆豉蛋白质的去除。

3.6 测定波长的选择 经查阅文献，淡豆豉总黄酮检测波长有322、260、261 nm[16-18]，本研究采用紫外分光光度法在200～400 nm波长范围内进行扫描，结果显示样品最大吸收波长为259～269nm，染料木苷的最大吸收波长为263～269 nm，故最终选定淡豆豉总黄酮的检测波长为260 nm。经查阅文献，淡豆豉多糖检测波长有490、450 nm[10,19]，本研究采用可见分光光度在400～800 nm波长范围内进行扫描，结果显示，样品最大吸收波长为485～488 nm，对照品最大吸收波长为482～486 nm，故最终选定淡豆豉多糖的检测波长为485 nm。

淡豆豉发酵过程主要包括两个阶段，分别是自然条件下发酵和闷制。淡豆豉发酵过程中总黄酮和多糖含量呈动态变化，推测该变化与淡豆豉发酵过程中微生物代谢过程，伴随着药效成分的转化有关。总黄酮和多糖含量动态分析结果显示，淡豆豉发酵时闷制发酵有助于总黄酮的累积，闷制与否对淡豆豉多糖含量影响不明显。综合总黄酮和多糖含量的动态分析，淡豆豉发酵过程闷制环节是必要过程。该结果可为淡豆豉的炮制原理和生产工艺研究提供参考。