笋头纤维对海兰褐蛋鸡育成期内脏器官指数、血浆激素含量和盲肠微生物区系的影响

张世忠 陈秀琴 陈盛星 蓝豪杰 江 斌 高炳辉黄兴樑 王隆柏* 刘 景*

(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州350013；2.中鲨动物保健品(厦门)有限公司，厦门361028；3.福建明良食品有限公司，南平353100)

近年来，随着我国蛋鸡养殖规模化程度的提高，养殖生产水平也得到不断提高。一段时间以来，以玉米-豆粕型为主的高能量、高蛋白质和低纤维的蛋鸡配合饲料的使用极大地降低了产蛋鸡的料蛋比，但随着抗生素使用的严格控制，以蛋鸡排饲料粪便、水样粪便和育成期腹脂过度沉积等问题日益突显，由此造成的饲料利用率降低和蛋鸡生殖系统发育不健全等问题也不断增加。研究表明，育成鸡饲粮中添加适量的膳食纤维，既可促进性腺的发育，又可促进骨骼的生长和增强消化系统的机能[1]。

在我国福建地区，竹笋食品生产加工过程中产生的数百万吨的笋头常作为下脚料被直接抛弃或作为植物栽培的基质使用，综合利用程度和经济价值低，资源得不到更好的利用。膳食纤维根据溶解度可分为不可溶性膳食纤维和可溶性膳食纤维[2-4]，笋头纤维以不可溶性纤维为主，并具有较大的纤维粒径[5]。笋头通过加工处理后可作为畜禽膳食纤维的优质原料，用于改善畜禽肠道健康。

研究发现，在饲粮中添加适量的膳食纤维，可促进肉鸡胃肠道的健康发育，改善家禽粪便质量，满足家禽的饱腹感，有利于家禽的健康和福利；也可以促进家禽的器官发育以及消化道酶的分泌，同时能够提高营养代谢率和生产性能，降低蛋禽的腹脂率[6-8]。目前尚无笋头纤维对蛋鸡生产影响的相关报道，本研究通过对海兰褐蛋鸡饲粮中添加笋头纤维研究其对海兰褐蛋鸡的内脏器官指数、血浆激素含量以及盲肠微生物区系的影响，以期为笋头纤维在蛋鸡育成阶段的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计及试验材料

试验选取体重达标、无疾病、生长性能相近以及采食正常的8周龄海兰褐蛋鸡384只，随机分为4个组，每组4个重复，每个重复24只鸡。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中分别添加10(试验Ⅰ组)、20(试验Ⅱ组)和30 g/kg(试验Ⅲ组)的笋头纤维。试验预试期7 d，正试期60 d。基础饲粮使用福建闽科饲料有限公司生产的蛋鸡育成期配合饲料，其组成及营养水平见表1。笋头纤维由福建某食品有限公司加工生产，其成分由中鲨动物保健品(厦门)有限公司进行检测，其组成见表2。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

续表1项目 Items含量 Content豆粕 Soybean meal23.0谷壳糠 Chaff barn6.8大豆油 Soybean oil3.0磷酸氢钙 CaHPO43.0氯化钠 NaCl0.2预混料 Premix1)1.0合计 Total100.0营养水平 Nutrient levels2)代谢能 ME/(MJ/kg)11.80粗蛋白质 CP15.49钙 Ca0.81有效磷 AP0.67赖氨酸 Lys0.73蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.64

表2 笋头纤维组成(烘干基础)

1.2 饲养管理

试验在福建省农业科学畜牧兽医研究所蛋鸡试验舍进行，采用半开放式鸡舍及3层层叠式笼养，每笼3只鸡，连续的8笼为1个重复。全程粉料饲养，蛋鸡自由采食、饮水，每日光照时间为16 h，自然光照和人工光照相结合。每日上午定时打扫鸡舍卫生和清理粪便，每周对鸡舍喷雾消毒2次。试验期间按常规免疫程序进行免疫。

1.3 样品采集

试验结束时，每个重复随机挑选3只体重接近本组体重中位数的蛋鸡进行采样，宰杀前12 h禁食空腹、自由饮水。翅下静脉采集5 mL左右的血液于肝素抗凝管中，于3 000 r/min下离心10 min制备血浆，置于-20 ℃冰箱保存。称量每只鸡的宰前活重，然后颈静脉放血致死，脱去羽毛后，记录屠宰体重，之后解剖，迅速分离各内脏器官，挤去肠道中的食糜，并用吸水纸吸去表面水分，记录肠道长度以及肝脏、脾脏、腺胃、肌胃和肠道的重量。分别于正试期第31天和第61天，每个重复随机挑选3只体重接近平均体重的蛋鸡屠宰，取适量盲肠内容物分别置于1.5 mL高压灭菌离心管中，用灭菌锡箔纸包好，并迅速放置于液氮中，然后于-80 ℃冰箱中冻存。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 器官指数

取腺胃、肌胃、脾脏、肝脏和肠道，剔除表面的结缔组织和脂肪等，并用滤纸吸干血水后称重，计算器官指数：

器官指数(%)=100×器官鲜重(g)/宰前活重(g)。

屠宰后测量肠道长度和重量(去除内容物)，计算肠道的校正长度：

肠道校正长度(cm/kg)=肠道长度(cm)/宰前活重(kg)。

1.4.2 血浆激素含量

使用北京华英生物技术研究所生产的试剂盒测定血浆中睾酮(TTE)、泌乳素(PRL)、雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH)、孕酮(P)和促黄体生成素(LH)含量。

1.4.3 盲肠微生物区系

称取(200±10) mg盲肠内容物样品置于2 mL离心管中，参照细菌基因组DNA试剂盒说明书提取盲肠菌群DNA，扩增16S rDNA基因V4～V5区，引物分别为515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。PCR反应体系：5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 4 μL，上、下游引物各1 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，DNA模板10 ng，加水至20 μL。反应条件：98 ℃预变性1 min；98 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27个循环；72 ℃延伸5 min。

样品送至广州基迪奥生物科技有限公司测序，将得到的序列去除低质量序列，经tags拼接、均一化处理、过滤和tags嵌合体去除后，得到有效数据。运用UPARSE软件来构建操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)，之后运用核糖体数据库项目(ribosomal database project，RDP)分类器对筛选出来的OTU逐一进行序列同源性比对以及种属分类学鉴定，用Mothur软件进行α多样性分析。

1.5 数据统计及分析

采用SPSS 19.0统计软件分别对各组数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法进行组间的多重比较，结果以“平均数±标准差”(mean±SD)表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡内脏器官指数的影响

由表3可知，各组蛋鸡末重、腺胃重量和指数、肝脏重量和指数以及脾脏重量和指数之间差异均不显著(P>0.05)；试验组蛋鸡肌胃重量和指数显著高于对照组(P<0.05)，且试验组之间差异不显著(P<0.05)；试验Ⅲ组蛋鸡肠道重量和指数显著高于对照组(P<0.05)，试验Ⅱ组和试验Ⅲ组肠道长度和肠道校正长度显著高于对照组(P<0.05)。

2.2 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡血浆激素含量的影响

由表4可知，试验Ⅱ组和试验Ⅲ组蛋鸡血浆雌二醇含量显著低于对照组(P<0.05)，试验Ⅲ组血浆孕酮含量显著高于其他组(P<0.05)，各组血浆促卵泡激素、睾酮和泌乳素含量之间无显著差异(P>0.05)，各组血浆促黄体生成素未检出(检测值为0)。

表3 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡内脏器官指数的影响

表4 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡血浆激素含量的影响

2.3 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡盲肠微生物区系的影响

2.3.1 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡盲肠微生物物种多样性的影响

由图1可知，每个样品观测到的OTU数量已经进入平台期，说明对微生物的测序接近饱和，当前的测序量足够覆盖样本中的大部分物种。α多样性分析可以反映微生物群落的丰度和多样性，包括ACE指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数4个指标。ACE指数是用于估计菌群中含有OTU数量的指数；Chao1指数用于评估菌群丰富度，数值越大代表样本中所含物种越多；Shannon指数在评估微生物多样性时综合考虑了群落的均匀度和丰富度，Shannon指数越大，群落多样性越高[9]；Simpson指数是用于估算样品中微生物多样性的指标之一，Simpson指数值越大[9-10]，群落多样性越低。

CK.1.1～CK.1.9和CK.2.1～CK.2.6代表对照组，T1.1.1～T1.1.9和T1.2.1～T1.2.6代表试验Ⅰ组，T2.1.1～T2.1.9和T2.2.1～T2.2.6代表试验Ⅱ组，T3.1.1～T3.1.9和T3.2.1～T3.2.6代表试验Ⅲ组。

由表5可知，第31天，试验组蛋鸡盲肠菌群Shannon指数显著高于对照组(P<0.05)，且试验组之间无显著差异(P>0.05)；各组盲肠菌群ACE指数、Chao1指数和Simpson指数之间均无显著差异(P>0.05)。结果表明，基础饲粮中添加10 g/kg的笋头纤维30 d即可显著提高蛋鸡盲肠菌群的多样性，而提高笋头纤维的添加水平并不能显著提高盲肠菌群的多样性，且饲粮添加笋头纤维对盲肠菌群的丰富度不产生显著影响。

表5 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡第31天盲肠微生物α多样性的影响

由表6可知，第61天，试验组蛋鸡盲肠菌群Chao1指数显著高于对照组(P<0.05)，且试验组之间无显著差异(P>0.05)；各组盲肠菌群ACE指数、Shannon指数和Simpson指数之间均无显著差异(P>0.05)。结果表明，基础饲粮中添加10 g/kg的笋头纤维60 d可显著提高蛋鸡肠道菌群的丰富度，且提高笋头纤维的添加水平不能显著提高菌群的丰富度。

2.3.2 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡盲肠微生物组成的影响

由图2可知，在门水平上，基础饲粮中添加笋头纤维30和60 d，4个组蛋鸡肠道菌群均主要为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)和互养菌门(Synergistetes)，其中拟杆菌门的相对丰度最高。由图3可知，在科水平上，基础饲粮中添加笋头纤维30和60 d，4个组盲肠菌群均主要为拟杆菌科(Bacteroidaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)。

表6 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡第61天盲肠微生物α多样性的影响

图2 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡盲肠微生物在门水平上组成的影响

图3 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡盲肠微生物在科水平上组成的影响

由表7和表8可知，在属水平上，各组蛋鸡盲肠菌群主要由拟杆菌属(Bacteroides)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、普氏菌属(Prevotella)、颤螺菌属(Oscillospira)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、萨特氏菌属(Sutterella)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)组成，其中拟杆菌属的相对丰度最高。第31天，与对照组相比，试验组蛋鸡盲肠副拟杆菌属、颤螺菌属和萨特氏菌属相对丰度显著提高(P<0.05)，且试验组之间差异不显著(P>0.05)；试验Ⅱ组盲肠考拉杆菌属相对丰度显著高于其他3组(P<0.05)；各组盲肠拟杆菌属、普氏菌属和瘤胃球菌属相对丰度之间均无显著差异(P>0.05)。第61天，试验组蛋鸡盲肠考拉杆菌属相对丰度显著低于对照组(P<0.05)，且试验组之间差异不显著(P>0.05)；各组盲肠其他菌属相对丰度之间均无显著差异(P>0.05)。

表7 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡盲肠微生物第31天在属水平上组成的影响

表8 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡盲肠微生物第61天在属水平上组成的影响

2.3.3 蛋鸡盲肠微生物差异物种分析

采用线性判别分析效应大小(LefSe)分析比较饲粮添加笋头纤维对蛋鸡盲肠菌群不同分类水平上的差异物种，结果显示：第31天(图4-A)，在科水平上，对照组的优势菌为甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)和脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)，试验Ⅰ组的优势菌为巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)和互养菌科(Synergistaceae)，试验Ⅱ组的优势菌为克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、韦荣氏菌科(Veillonellaceae)和产碱菌科(Alcaligenaceae)；第61天(图4-B)，试验Ⅲ组的优势菌为脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)和疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)。综上可知，饲粮添加笋头纤维可显著提高蛋鸡盲肠益生类菌如产碱菌科和疣微菌科的相对丰度(P<0.05)。

圆圈由里到外表示物种分类水平由门到属，差异物种用彩色圆圈和扇形表示，每个圆圈的直径与该物种的相对丰度成比例，黄色圆圈表示差异不显著(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡内脏器官指数的影响

畜禽的器官指数是一种生物学特性指标，是器官功能性的反映[11]，也可以反映机体系统的发育状况，直接影响机体代谢水平[12]。本试验结果表明，饲粮添加笋头纤维可提高育成期海兰褐蛋鸡肌胃指数、肠道指数、肠道长度以及肠道校正长度。研究表明，纤维能够促进家禽肌胃和肠道的发育，并使其重量和容积有所增加[13-15]，本研究结果与此一致。同时，笋头纤维具有良好的吸水膨胀性使肌胃容积增大，增加蛋鸡的饱腹感，从而减少异食癖的发生；另外，笋头纤维可以避免蛋鸡在育成阶段因为控料而引起的腺胃和肌胃变小，造成蛋鸡开产后采食量无法达标，从而影响蛋鸡的产蛋水平。此外，本试验中，试验Ⅲ组蛋鸡肠道重量和指数显著高于对照组，试验Ⅱ组和试验Ⅲ组肠道长度和肠道校正长度显著高于对照组。李刚等[16]研究发现，饲粮添加8.5%苜蓿纤维可显著提高肉鸡的十二指肠和盲肠指数，这与本研究结果相一致。不过，本试验中，各组蛋鸡腺胃指数、肝脏指数和脾脏指数之间差异均不显著，其中肝脏指数与李刚等[16]研究中肝脏指数极显著差异结果不太一致，这可能与纤维的种类、添加水平和添加时长有关。彭涵等[17]研究发现，饲粮添加纤维能够刺激大恒优质肉鸡胃肠道的发育，增加十二指肠绒毛的长度，提高十二指肠与营养物质的接触面积，从而促进营养物质的吸收利用。当前，为了应对粮食危机，我国农业农村部实施的“猪鸡饲料玉米豆粕减量替代技术”行动中，提倡通过提高饲粮中纤维的添加量减少玉米、豆粕的用量，提高饲料原料的利用率，保障粮食安全。而本试验结果表明，在蛋鸡饲粮中添加笋头纤维能够促进蛋鸡胃肠道的发育，进而改善蛋鸡的肠道健康。

3.2 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡血浆激素含量的影响

蛋鸡体内的各项激素主要通过下丘脑-垂体-卵巢性腺轴进行分泌调节[18]。雌二醇作为蛋鸡体内重要激素之一，能够维持生殖系统的健康。蛋鸡卵泡的生长发育与促卵泡素有着密切关系，血浆中促卵泡素含量下降会导致卵黄合成缓慢，影响蛋鸡的生产性能。当前，有关笋头纤维在蛋鸡生产中的应用和对蛋鸡血浆中激素含量影响的研究较少。本试验结果表明，饲粮添加笋头纤维能够显著降低蛋鸡血浆中雌二醇含量，其中对照组最高为515.67 pmol/L，试验Ⅲ组最低为360.67 pmol/L，对照组与试验Ⅱ组和试验Ⅲ组之间差异显著。这与宋扬等[19]研究结果相一致。此外，试验Ⅲ组蛋鸡血浆促卵泡激素含量高于对照组，而促卵泡激素是促进蛋鸡卵泡发育成熟的主要启动子[20]；试验Ⅲ组血浆孕酮含量最高为1.73 nmol/L，显著高于对照组。生殖激素与机体骨沉积有密切关系，可能影响蛋壳品质[21]，但本试验仅在蛋鸡开产前阶段开展，故无法得以验证。各组蛋鸡血浆中睾酮、泌乳素含量较低，且差异均不显著，血浆促黄体生成素在本次试验中均未检出。

3.3 饲粮添加笋头纤维对蛋鸡笋头纤维对盲肠微生物区系的影响

膳食纤维被营养界认为是“第七大营养素”，它具有多种功能。首先，膳食纤维可促进生长发育，提高机体免疫力；其次，其可以通过促进益生菌的生长来防治肠道疾病；最后，膳食纤维对胃肠道黏膜具有保护作用[22]。目前，在基础饲粮中添加膳食纤维对蛋鸡肠道菌群组成的影响鲜有报道，本试验在蛋鸡基础饲粮中添加不同水平的笋头纤维，研究笋头纤维对盲肠菌群多样性和物种组成的影响。

肠道菌群对机体具有多方面的作用，包括生理营养作用、拮抗作用以及参与宿主代谢等[23]。机体内肠道菌群的组成维持动态平衡有利于健康[24]。α多样性指数是用来反映单个样品的物种丰度及物种多样性的指标，其中Shannon指数是衡量物种多样性，Chao1指数是衡量物种丰度[25]。本试验中，在基础饲粮中添加笋头纤维可显著提高蛋鸡盲肠菌群Shannon指数，添加60 d可显著提高盲肠菌群Chao1指数，且笋头纤维的添加水平由10 g/kg提高到30 g/kg均未对Shannon指数和Chao1指数产生显著影响。因此，在基础饲粮中添加10 g/kg的膳食纤维30和60 d可分别显著提高蛋鸡盲肠微生物群落的和丰富度和多样性。

本试验中，在门水平上，4个组蛋鸡盲肠菌群均主要由变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门组成，其中相对丰度最高的是拟杆菌门，这与前人的研究结果[26]一致。而厚壁菌门含有大量分解纤维的细菌[27]。Chen等[28]研究表明，番鸭的肠道菌群也主要由以上3种门组成，表明肠道菌群的组成具有相对稳定性且家禽的肠道菌群具有相似性。从属水平分析各组的菌群结构差异，结果表明，基础饲粮中添加笋头纤维可显著提高副拟杆菌属、颤螺菌属和萨特氏菌属的相对丰度，添加20 g/kg的笋头纤维可显著提高考拉杆菌属的相对丰度。差异物种分析表明，基础饲粮中添加笋头纤维可显著降低蛋鸡盲肠甲烷杆菌科、肠球菌科和脱硫弧菌目的相对丰度，显著提高盲肠巴恩斯氏菌科、互养菌科、克里斯滕森菌科、韦荣氏菌科和产碱菌科的相对丰度。肠球菌科是一类条件性致病菌，该菌会导致Toll样受体5(TLR5)缺失小鼠发生肠炎[29]。副拟杆菌属不仅可调节脂肪代谢，还可通过减少炎症来改善肠道屏障功能[30]。Wu等[31]给高脂诱导的小鼠喂食副拟杆菌，发现其通过增加脂肪组织产热、降低肠道炎症和胰岛素水平等途径改善了小鼠的肥胖症状。萨特氏菌属可缓和抗生素引起的腹泻[32]。因此，基础饲粮中添加笋头纤维可抑制蛋鸡肠道内的条件性致病菌的生长，促进益生菌的生长。

4 结 论

① 在育成期海兰褐蛋鸡饲粮中添加30 g/kg笋头纤维能够提高蛋鸡肌胃指数、肠道指数、肠道长度以及肠道校正长度，有助于改善蛋鸡胃肠道的发育。

② 饲粮添加笋头纤维可降低蛋鸡血浆雌二醇含量，提高血浆孕酮含量，有利于改善蛋鸡在育成阶段血浆中的激素含量。

③ 饲粮添加笋头纤维前期可显著提高蛋鸡盲肠微生物群落的多样性，后期可显著提高微生物群落的丰富度，并通过提高有益菌数量、抑制条件性致病菌繁殖，改善肠道健康。

④ 在育成期海兰褐蛋鸡饲粮中以添加30 g/kg笋头纤维效果较佳。