光响应水凝胶在生物医学领域应用的研究进展

梁屹 裴锡波 万乾炳

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院修复科 成都610041

水凝胶是1种亲水聚合物合成材料，具有高含水量和质地柔软的特性，可用于调节细胞功能和组织形态[1-2]。传统水凝胶大多具有静态和各向同性的特性，无法适应动态和非均匀的体内环境。

光响应水凝胶由聚合物网络和光响应基团组成，通过光响应基团将光信号转化为物理或化学信号，继而控制水凝胶的物理或化学性质，影响其微结构，调控细胞的行为如黏附、迁移和分化[3]。并且由于光的高度时空控制和各种光敏基团的可用性，光响应水凝胶在需要精确的时空生物配基的生物医学应用中得到广泛采用，例如材料整合和血管化，靶向微米/纳米颗粒到癌症和炎症的病变部位，以及作为细胞培养平台[4]。

1 光响应水凝胶的分子机制

光响应水凝胶可利用不同波长的光信号通过光敏基团产生光响应，将光信号转化为各种物理或化学信号，改变光响应水凝胶的物理或化学性质，实现对细胞的动态调节。为了实现光响应水凝胶在生物医学领域的广泛应用，许多光敏基团已被用于制造光响应水凝胶。常见光敏基团的光反应类型主要有二聚化反应、裂解反应、异构反应。以硫醇-烯、香豆素为代表的光响应基团在光照条件下光致二聚化，为水凝胶提供了丰富的交联点。硫醇-烯点击反应产率高而且副产物少，目前广泛应用于光响应水凝胶的合成。Xin等[5]在365 nm的紫外光下引发二巯基聚乙二醇上的巯基和四臂聚乙二醇-降冰片烯中的烯键发生点击反应制造了稳定的微凝胶。而香豆素基团可在365 nm波长的照射下通过[2+2]-环加成反应生成环丁烷二聚体，同时环丁烷二聚体在280 nm以下的光照下可发生裂解[6]。因此某些二聚体基团可在光照条件下进行交联-脱交联，实现光响应水凝胶的凝胶-溶胶转变，利用其特性可作为一种按需给药的优良载体。

此外，可通过将光致裂解基团如邻硝基苄酯与水凝胶骨架整合，光照后使水凝胶网络发生不可逆的破坏，导致水凝胶网络的物理或化学性质发生改变。Lunzer等[7]利用硫醇修饰的透明质酸结合含有邻硝基苄酯基的聚乙二醇连接剂在320～500 nm光照下发生水凝胶的光降解，降低水凝胶交联程度增加了其溶胀能力。

常见的光异构化基团包括偶氮苯和螺吡喃。这些光响应基团在紫外或可见光照射下能够发生可逆异构化，从而导致水凝胶网络的亲水-疏水转变[8]。Homma等[9]利用偶氮苯的异构化导致其极性改变使水凝胶在365 nm和436 nm两种不同波长的光照下发生可逆的溶胶-凝胶的转化。此外，Li等[10]还将螺吡喃掺入水凝胶中，在紫外线的照射下实现螺吡喃从疏水闭环到亲水开环的转变，通过光引发水凝胶的膨胀。

2 光响应水凝胶在生物支架中的应用

光响应水凝胶在空间和时间上具有高度可调的物理和化学特性，可以在光刺激无接触下改变支架形状，模拟组织生物力学的动态特性，远程和无接触地调控细胞生长，促进细胞的增殖与分化[11]。将细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分的肽基类似物引入光响应基团，并将其作为光响应生物墨水，与三维光刻打印技术和光纤技术结合，可制造具有精确复杂结构和多种生物活性因子定位的的光响应水凝胶支架，对细胞进行三维化引导，促进多种组织缺损的修复。

2.1 具有精确复杂结构的光响应水凝胶支架

近年来，明胶由于具有良好的生物相容性以及低免疫原性等方面的优势被广泛应用[12]。通过将明胶甲基丙烯酰化可使其具有光交联特性。Cidonio等[13]利用3D打印技术将甲基丙烯酰明胶（methylacryloyl gelatin，GelMA）生物墨水光交联，加入纳米硅酸盐增加强度和黏性，制造嵌合缺损部位的水凝胶支架，并将血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）加入到水凝胶支架中以模拟间充质干细胞（mesenchyml stem cells，MSCs）的三维细胞微环境，观察到良好的成血管和成骨现象。Zhu等[14]将光响应基团丙烯酸酯基引入聚乙二醇，结合软骨外基质，光交联制备了1种类软骨的聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol diacrylate，PEGDA）光响应水凝胶支架用于软骨缺损修复。植入物采用立体光刻技术结合3D打印拥有精确的结构，同时天然软骨外基质保留软骨诱导特性，模拟原生微环境，促进间充质干细胞的软骨分化。光响应水凝胶支架还可通过改变自身刚度拥有与体内细胞外基质相似的弹性模量对细胞进行三维化的引导。有学者[15]利用光交联生物油墨呋喃基—明胶，开发出1种弹性模量为9.76 kPa，与天然心肌组织力学特性相似的支架。在此支架上以1∶1比例培养心肌细胞和心肌成纤维细胞后分别用肌钙蛋白Ⅰ和成纤维细胞特异性蛋白Ⅰ染色，显示这2种细胞发生均匀耦合并表现出良好的活力。此外光响应水凝胶支架可通过改变生物墨水的组成使其拥有更好的力学性能。Xu等[16]便通过改变聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯光响应水凝胶的组分，利用其光交联特性，制造出弹性和柔韧性可变的水凝胶支架。利用光响应水凝胶制造高精度和复杂的三维支架依赖于先进的制造技术和具有良好生物学特性的生物墨水。因此如何在光响应水凝胶基础上设计理想的3D打印油墨将继续成为一个重要的话题。

2.2 定位多种生物活性因子的光响应水凝胶支架

虽然许多支架均可以为细胞提供三维培养环境，但支架上缺少生物活性因子使其缺少与细胞之间的动态互动。利用光响应水凝胶支架对光响应的特性可以将多肽和生长因子等生物活性分子固定或释放，动态调控细胞的黏附，增殖和分化。Cai等[17]利用聚甲基丙烯酸酯羟乙基与苯基叠氮化合物构建带有导管的大孔光响应水凝胶支架，利用光导纤维在270 nm波长的光照下使叠氮苯光敏基团光交联实现胶原蛋白固定在水凝胶导管内表面。神经干细胞（neural stem cells，NSCs）优先黏附于蛋白固定的区域，促进神经干细胞的分化，神经元定向伸长和神经再生。Li等[18]将光响应基团硝基苄基加入胶原模拟多肽（collagen mimetic peptides，CMP）主链中，利用空间位阻抑制CMP与明胶聚合物链之间三重螺旋杂交，之后通过紫外光照射使硝基苄基裂解导致空间位阻的降低引发多肽固定在水凝胶上，在水凝胶中实现细胞黏附的空间控制。

体内多种组织都具有高度的层次性，从单个细胞到复杂的组织，这种结构对维持正常的生理功能非常重要。光响应水凝胶支架为修复缺损组织提供了1种新的方法。通过光响应水凝胶支架高度排列的纳米结构以及多种生物活性因子的定位，引导细胞定向生长，最终在缺损间建立1个完整的桥梁，形成新组织完成缺损的修复。

3 光响应水凝胶在给药系统中的应用

水凝胶是高分子链交联形成的高含水量三维网络，由于其可调的物理、化学和生物学特性，目前被广泛应用于药物传递中，增强药物的循环半衰期，提高药物的生物相容性[19-20]光响应水凝胶因其具有高时空分辨率的非接触降解，为药物传递提供了新的可能性[21]。光响应水凝胶可利用光热效应发生凝胶—溶胶相变释放负载药物，同时可利用自组装光响应水凝胶通过光聚合或光裂解来达到释放药物的目的[22]。因此，光响应水凝胶被认为是1种用于药物运输达到按需给药目的的理想载体。

3.1 基于光热效应的凝胶-溶胶相变的给药系统

对近红外光（near infrared，NIR）敏感的水凝胶利用光热效应，通过光敏剂将光转化为热触发光响应水凝胶的凝胶—溶胶相变，软化或融化载药水凝胶的纳米结构从而释放药物[23]。光照强度大小和暴露时间长短可准确控制药物释放速率。有学者[24]以环糊精和包覆铂纳米粒子的聚乙二醇为原料，合成了1种近红外光响应按需降解的水凝胶给药系统。近红外光照射不同时间，水凝胶网络可被部分破坏，达到近红外光照射精确控制药物释放的目的。黑磷（black phosphorus，BP）是1种新发现的材料，具有光热转换效率高，良好的生物相容性和高载药能力的特点[25-27]。有学者[28]报道了1种基于黑磷的利用近红外光进行光热转换的光响应水凝胶载药系统。BP@Hydrogel在1 W·cm2照射下可升高10℃以上，可循环重复6次，经历可逆的软化；当激光功率增加到1.5 W·cm2时，温度急剧升高，水凝胶逐渐熔化，达到控释药物的目的。与健康组织相比，肿瘤细胞对热的耐受性较低。因此，可利用上述水凝胶特性，用于光热与化疗的联合使用。NIR响应的水凝胶具有光开关特性，在载药方面有很好的应用前景，但设计1种能够通过不同波长的光动态控制载药凝胶的硬化/软化达到按需给药更具实用性。Zheng等[29]设计了1种对紫外线和近红外光均有反应，刚度可调的双光响应超分子凝胶。紫外线照射水凝胶诱导反式偶氮转变为顺式偶氮从而软化凝胶；近红外光照射凝胶进行光—热转换，触发热响应聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺[poly（N-isopropylacrylamide），PNIPAAm]亲水—疏水转变，凝胶硬化。但由于紫外线是一种高能电磁波，对组织的渗透性很差。Hu等[30]使用转化纳米粒子（up-conversion nanoparticles，UCNPs）结合偶氮键，利用近红外光的光热效应同时发射紫外线引起凝胶—溶胶的转换，实现光调节药物释放的目的。

3.2 基于自组装的光响应水凝胶的给药系统

当光响应水凝胶与生物分子如多肽、蛋白质、多糖生物分子之间通过可逆的非共价连接时，可以更大程度的发挥水凝胶纳米结构的通用性，灵活性及高敏感性。因此，这种以自组装为基础的光响应水凝胶是1种很有前途的药物输送平台，受到了相当大的关注。

利用自组装结合生物分子的光响应水凝胶作为药物的释放平台，在治疗癌症或者细菌感染方面表现出明显的优势。Wang等[31]使用光响应MnO2纳米片利用自组装制备了仿生二氧化锰混合（bioinspired MnO2hybrid，BMH）水凝胶。在808 nm的光照下MnO2纳米片将内源性过量的H2O2催化分解产生O2缓解肿瘤微环境乏氧，同时释放抗肿瘤药物盐酸阿霉素杀伤肿瘤细胞；同时利用MnO2纳米片的“纳米刀片”效应破坏细胞膜，有助于杀灭细菌，促进感染创面的愈合。相较于传统共价生物偶联得到静态结构的水凝胶，自组装的超分子水凝胶分子之间的动态非共价键有助于在键的生成和解离之间建立动态平衡。Grim等[32]设计了1个烯丙基硫化物手柄，允许在细胞负载的光响应水凝胶中通过光催化硫醇-烯点击反应实现信号蛋白从水凝胶中完全可逆和重复地捆绑。此外，基于自组装的超分子水凝胶在控制其力学性能方面具有很高的灵活性。Jiang等[33]利用多聚组氨酸标签标记具有腺苷钴胺素结合域的感光蛋白（photoreceptor C-terminal adenosylcobalamin binding domain，CarHC），将多聚组氨酸标签标记的感光蛋白通过与过渡金属离子络合，并利用CarHC在黑暗中与辅因子AdoB12结合后自组装，形成具有一定强度可注射的光响应水凝胶，并将负载白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的水凝胶注射到受伤的小鼠视神经中，通过522 nm的绿光照射使AdoB12中的C-Co键断裂，导致凝胶—溶胶转变，释放LIF促进轴突再生。

虽然目前通过光激活水凝胶释放药物仍有较多挑战需要解决，如聚合物载体与光源的距离、光穿透组织的密度，以及药物在光照下降解的可能性等，但是利用光刺激传递药物具有可以对非侵入性的触发做出反应等优良特性，为研究者提供了1种不需要直接与患者接触的远程激活方法。

4 光响应水凝胶在细胞封装中的应用

有研究[34]表明细胞的表型和功能受到细胞外基质机械性能的影响，因此模仿原生细胞外基质的生物材料可以在体外模仿细胞微环境，调节细胞行为。然而，许多研究[35-36]表明，体外二维细胞培养环境和原生细胞微环境在物理和化学性质上的巨大差异，无法维持来自复杂多细胞组织的细胞表型。鉴于光响应水凝胶可以远程和无接触地改变细胞生长条件，因此可通过光响应水凝胶封装相关细胞或生物信号进行三维细胞培养在体外重现原生细胞微环境。随着生物打印技术和各种微流控平台等各项生物制造技术的发展，将其与光响应水凝胶结合，能扩宽光响应水凝胶在生物工程领域如药物筛选，再生医学的应用。

4.1 传统块状光响应水凝胶作为细胞培养平台

细胞外基质具有各种物理和生化信号，为细胞提供了一个复杂动态的微环境。这些ECM信号调节细胞行为在不同维度上会产生不同结果。例如，在二维和三维培养条件下间充质干细胞机械响应的明显差异已被报道[37]。细胞外基质弹性模量是1种动态特性，在各种生物过程中发生变化，如疾病进展或伤口愈合。然而，大多数细胞培养平台表现出的静态特性，并不能有效的研究不同弹性模量对细胞表型及其功能的影响。最近，Lee等[38]便基于聚丙烯酰胺水凝胶，利用偶氮苯分子的光异构化，开发出1种通过光照改变其肿胀和硬度的光响应水凝胶，通过紫外线照射凝胶软化与可见蓝光导致硬化，更好的理解骨髓基质干细胞机械传导信号通路过程。光响应水凝胶作为细胞的三维培养环境，利用光照可以远程非接触的控制其局部的理化特性。最近，Crosby等[39]合成了1种由胶原蛋白和被降冰片烯修饰的透明质酸组成的光响应水凝胶正交网络，通过改变光响应交联剂的浓度和顺序来调节水凝胶的局部刚度和降解性，发现多能干细胞（induced pluripotentstemcells，iPSCs）在局部血管化程度的差异。该项实验为研究者提供了1种可用于研究细胞对不同微环境反应差异的细胞培养平台。

4.2 结合微流控平台的光响应水凝胶用于细胞封装

微流控是1种可精确控制和操控微尺度流体尤其是亚微米结构的技术，把生物化学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到1块微米尺度的芯片上，自动完成分析过程。同时，微流控系统被认为是快速生产均匀微球（microspheres，MSs）最有效的方法。鉴于光响应水凝胶的光敏特性，光响应水凝胶可以与各种微流控平台结合，制造光响应水凝胶微球，将细胞封装在微球内，或者是播种在微球表面，作为微载体，扩展光响应水凝胶的临床应用范围。Seeto等[40]以微流控设备为基础，设计了1种新的微流控平台，利用PEGDA、GelMA和纤维蛋白原（fibrinogen，PF）光交联制备水凝胶微球，将每毫升6×106的细胞均匀封装在微球中，保持较高的细胞活力和功能活性。微球系统由于其高表面/体积比和仿生环境，有利于细胞的扩张和移植。He等[41]利用数字光处理技术，结合微流控技术制备了Gel-MA MSs，并将MSCs细胞封装在微球内，将Gel-MA MSs作为MSCs扩散、迁移和增殖的载体，简化了细胞培养的操作流程，并构建了细胞分布均匀、功能特异的大组织。微流控平台的高精度能够更精确地制造仿生显微组织的微尺度特征，所以能更加准确的封装细胞并在体外模拟细胞三维微环境。Zheng等[42]通过微流控平台将光诱导电沉积（photoinduced electrodeposition，PIED）产生装载成纤维细胞的海藻酸盐水凝胶微球重组排列成具有高精度微结构和形态特征的三维显微组织。微流控已经成为1种通用且对细胞友好的图案化技术。水凝胶前体溶液中的悬浮细胞通过微流控系统并不会沉淀到底部，从而能将细胞均匀地封装到三维水凝胶微球中。在未来光响应水凝胶可利用微流控技术结合立体光刻等制造技术封装多种细胞，添加调节细胞增殖和分化的生物分子合成具有高精度复杂结构的大组织和类器官。

5 光响应水凝胶在口腔医学中的应用

细菌感染是导致牙体硬组织与牙周组织破坏的主要原因。全身给药往往导致致病菌产生耐药性，增加重复感染的风险。因此近年来，可注射水凝胶作为1种极具前景的局部给药平台受到越来越多的关注。水凝胶中加入无机纳米粒子或纳米纤维是改善水凝胶注射性能的1种简单而有效的方法。因此，Ribeiro等[43]将环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）和β-环糊精（β-cyclodextrin，β-CD）包合物掺入静电纺聚合物纤维中，随后将其切割成短纳米纤维（short nanofibers，SF），嵌入到GelMA中，得到可注射的抗菌水凝胶。实验结果表明抗菌水凝胶可维持有效药物浓度较长时间，对粪肠球菌生物膜有良好的抗菌效果，有助于根除在感染牙周组织、根管系统或根尖周组织中定植的微生物及其毒副产物。β-CD的加入增加了CIP的溶解度和赋予GelMA降解度可调的特性，同时水凝胶与纳米纤维之间动态的相互作用使水凝胶具有剪切变薄和自愈合的性能。

牙周炎常导致牙周组织，特别是牙槽骨的缺损，甚至是牙齿脱落。当牙周炎病情控制后缺损的牙周组织也很难恢复，将牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）与可注射水凝胶相结合被认为是治疗牙周组织缺损的1个有前途的策略。Ma等[44]制备了不同GelMA/PEGDA体积比的可注射光交联水凝胶，并将PDLSCs封装在此水凝胶中，在大鼠牙槽骨缺损中注射GelMA/PEGDA前体溶液并进行原位紫外光交联。此水凝胶作为牙周膜干细胞的运载工具与培养基质，减少由于机械力所导致的细胞损伤，同时作为生物支架填补缺损为PDLSCs的生长提供空间。随后的显微CT和组织学研究证实，缺损处有明显的新骨形成。因此，在未来研究当中可进一步对基于光响应水凝胶的ECM成分与干细胞类型的组合筛选，更好地应用于牙周组织工程当中。

综上所述，水凝胶所具有的亲水性，使其在模拟细胞微环境方面具有天然优势。大多数聚合物都可以用光响应基团修饰，然后在光照射下发生多种光反应。因此，许多材料均可通过添加光响应基团制备光响应水凝胶。光响应水凝胶可以动态指导细胞行为，控制局部微环境，因此可在不同生物医学领域中应用，包括作为支架用于神经元的定向迁移、心脏纤维的形成和药物的光释放以及细胞培养平台。然而，利用光响应水凝胶制造支架和封装细胞时在紫外线照射下形成的自由基可能导致DNA的损伤和细胞功能的损害。为更好的应用临床，人们利用可见光甚至是红外光来诱导光反应。此外，使用光响应水凝胶作为体内的药物载体，光的穿透深度有限是限制光响应水凝胶应用的主要原因。同时，光响应水凝胶载药时光热转换效率低、生物安全性和生物降解性较低、难以代谢出体内、细胞毒性等，仍然是其临床应用时所需要解决的问题。

在未来光响应水凝胶的研究中，仍将以其光响应特性作为研究重点，通过与多种生物制造技术如三维生物打印，光刻技术及微流控技术等结合，最大限度地解决光响应水凝胶目前所面临的困境与使用的局限性。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。