晚期膀胱癌免疫治疗反应的生物标志物研究进展

张子威，张文涛，毛卫浦，姚旭东

1同济大学附属上海市第十人民医院泌尿外科，上海200072；2海军军医大学附属长海医院泌尿外科；3东南大学附属中大医院泌尿外科

膀胱癌是全球最普遍的恶性肿瘤之一，我国膀胱癌的患病率和病死率仍居高不下。根据膀胱癌的临床TNM分期，可以将膀胱癌分为非肌层侵润型膀胱癌、肌层侵润型膀胱癌和转移性膀胱癌。在过去几十年中，晚期膀胱癌的治疗方案都以联合化疗为主，但是其整体存活率一直不理想[1-2]。近年来，免疫治疗在晚期膀胱癌的治疗中取得了突破性进展，免疫检查点抑制剂(ICI)的出现给晚期膀胱癌患者的治疗带来了希望。但如何精准识别对免疫治疗敏感的优势人群仍是目前亟待解决的问题。用于晚期膀胱癌免疫治疗反应的相关生物标志物大致分为三类：第一类是与肿瘤细胞相关的标志物，如肿瘤内异质性、肿瘤基因突变负荷、DNA损伤修复、分子分型等；第二类是与肿瘤微环境相关的标志物，如肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)、程序性死亡蛋白配体1(PD-L1)等；第三类是与液体活检相关的标志物，如游离DNA(cfDNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞(CTC)等。现将晚期膀胱癌免疫治疗过程中可能存在的生物标志物综述如下。

1 肿瘤细胞相关的标志物

1.1 肿瘤内异质性 肿瘤内异质性是指肿瘤细胞在其分子特征上不同，表现为同一肿瘤在不同时空可以存在多种不同基因型或亚型的细胞，这与癌症的进展、治疗抵抗和复发密切相关[3]。由此可以解释，在临床中，为何同一肿瘤在不同个体上甚至在同一个体不同时间节点上的免疫治疗效果却千差万别。具有高肿瘤内异质性的患者对治疗反应更差，这可能是肿瘤患者临床预后不佳的一个标志物[4]。有学者认为，高肿瘤内异质性有利于免疫逃避，是因为新抗原数量越多，免疫反应就相对越差[5]。一项对6种肿瘤的249例患者进行全外显子组测序的研究显示，在膀胱癌中，具有高肿瘤内异质性(>50%亚克隆突变)的肿瘤对ICI无反应相关，并且与肿瘤细胞突变相关的特征往往是相互关联的[6]。晚期膀胱癌是一种具有高度异质性的肿瘤，通过液体活检和单细胞测序等技术来破译膀胱肿瘤的异质性并揭示其潜在的分子机制具有重要的临床意义。

1.2 肿瘤基因突变负荷 肿瘤基因突变负荷是指肿瘤细胞中每兆基因编码区发生突变的总数，其在不同肿瘤、不同患者之间有很大的差别[7]。具有高肿瘤基因突变负荷的肿瘤患者，其同一节段外显子编码区中的突变碱基更多，可以产生更多的新抗原被抗肿瘤T淋巴细胞识别，从而激发抗肿瘤的免疫效应。突变相关新抗原是由非同义突变产生的突变蛋白，其免疫原性比其非突变的对应物更强。

生物信息学研究显示，在膀胱癌中，高肿瘤基因突变负荷组倾向于促进CD4+、CD8+T淋巴细胞和NK细胞的渗透，肿瘤基因突变负荷较高的患者更有利于进行免疫治疗[8]。由此推测，高肿瘤基因突变负荷一方面可能与新抗原的存在有关，另一方面可能与肿瘤基因突变负荷相关基因引起肿瘤微环境的变化相关。一项Ⅱ期临床试验也发现，高肿瘤基因突变负荷膀胱癌患者的病理缓解率更高，对于抗派姆单抗临床治疗的效果更好[9]。然而在有些肿瘤中，一些低肿瘤基因突变负荷的患者中也观察到了对ICI的反应，即反应者与无反应者之间的肿瘤基因突变负荷范围存在着显著重叠[10]。也就是说，客观的肿瘤反应并不是完全由体细胞突变所驱动，基因组或非基因组的特征改变也参与了抗肿瘤免疫反应。

由于目前在临床中的检测手段还不够成熟、临界值的界定还不够明确以及肿瘤间和肿瘤内的异质性等因素的限制，使肿瘤基因突变负荷在临床应用中作为免疫治疗的标志物还面临诸多困难。

1.3 DNA损伤修复 DNA损伤修复在癌症进展中非常重要，当其调节失败时，会导致更高的基因组不稳定性、突变率增加和肿瘤内异质性增强[11]。DNA损伤修复机制中的缺陷，包括微卫星不稳定(MSI)/错配修复缺陷(dMMR)、DNA聚合体突变等。WANG等[12]通过cBioPortal数据库分析DNA聚合酶ε/DNA聚合酶δ1(POLE/POLD1)在不同类型癌症患者中的突变水平，结果显示，非黑色素瘤皮肤癌患者的突变水平最高，膀胱癌患者的突变水平排在第5位，并且这些突变患者的肿瘤基因突变负荷明显高于没有突变的患者。

已有研究表明，在晚期膀胱癌患者中，DNA损伤修复基因突变可提高对顺铂化疗的敏感性[13]。一项前瞻性试验纳入60例晚期膀胱癌患者，给予PD-1/PD-L1抑制剂后，在已知的或未明确的DNA损伤修复基因突变患者中，客观缓解率均明显高于没有DNA损伤修复突变的患者[14]，这表明DNA损伤修复改变对晚期膀胱癌的免疫治疗具有预测价值。VIDOTTO等[15]报道，DNA损伤修复基因突变与肌层浸润性膀胱癌中肿瘤免疫检查点基因表达有关，包括PD-1、PD-L1、IDO1、TIGIT、TIM-3、TGFB1、LAG3等，这表明某些特定DNA损伤修复基因的突变对免疫治疗具有特殊的指导意义。

膀胱癌的生物学进展常伴随多种DNA损伤修复基因的突变，因此，将DNA损伤修复缺陷状态同其他肿瘤细胞相关生物标志物一起进行研究可以更好地预测对ICI的反应性。

1.4 分子分型 基因突变是否产生肿瘤新抗原不仅取决于突变的数量，与突变的类型也密切相关。根据膀胱癌的分子特点不同，膀胱癌的分子分型方法主要包括北卡罗来纳大学(UNC)二分法、基因组图谱(TCGA)四分法、安德森癌症中心(MDA)三分法以及隆德大学(Lund)五分法。

一项PD-L1抑制剂阿特珠单抗在晚期膀胱癌中的Ⅱ期研究显示，TCGA四分法中的管腔样Ⅱ亚型患者有效率最好，为34%，而管腔样Ⅰ亚型患者有效率最差，为10%[16]。与之类似的另外一项研究发现，尽管CD8+效应基因表达在基底Ⅲ/Ⅳ亚型中升高，但与管腔样Ⅱ亚型相比，其反应率降低，强烈提示还存在其他免疫抑制因子在不同分型中发挥作用[17]。一项来自368个膀胱肿瘤样本的转录组分析显示，“基因组不稳定”的Lund亚型分类对免疫疗法的反应性最佳[18]。其潜在的机制可能是与低水平的TGF-β表达和高突变/新抗原负荷相关，更大规模的临床研究和分子机制还有待于进一步验证。MC CONKEY等[19]则指出，在MDA三分法中p53样型膀胱癌患者对化疗明显耐药，提示对于p53样型膀胱癌患者可优先考虑免疫治疗方案。膀胱癌的分子分型对进一步了解膀胱癌患者的潜在免疫生物学特性以及开发合理的序贯治疗策略具有重要意义。

2 肿瘤微环境相关的标志物

2.1 TILs TILs是存在于肿瘤微环境中的一群高度异质性免疫细胞，以CD4+、CD8+T淋巴细胞为主。TILs在肿瘤的发生发展中具有重要意义，与许多肿瘤的免疫治疗反应及预后相关。LEKO等[20]报道，从5例膀胱癌患者的肿瘤组织中分离、培养TILs，发现1例之前接受过卡介苗治疗的患者CD4+TILs亚群特异性识别了转录抑制因子CTBP1中的一个突变点。这一发现提示，新抗原反应性TILs存在于膀胱癌中，也就是说TILs升高有可能是膀胱癌患者对免疫治疗敏感的一个标志。此外，在包括IMvigor210在内的研究中显示，TILs的存在也预示着尿路上皮癌对ICI的反应有利[21]。TILs亚群与免疫治疗的预后也具有相关性，CD8+TILs的存在与肌肉浸润性尿路上皮癌患者的生存率提高有关，而免疫抑制调节性T淋巴细胞和巨噬细胞的存在与其生存率降低相关[22]。因此，肿瘤微环境中免疫细胞的数量和亚群对免疫治疗的临床获益密切相关。

临床中，肿瘤免疫微环境的改变对膀胱癌的治疗具有重要的指导意义。由此推测，将肿瘤微环境中的标志物和肿瘤细胞本身的相关标志物结合，可能对免疫治疗具有更强的阳性预测价值。

2.2 PD-L1 PD-L1是目前研究最为广泛的免疫抑制剂预测性生物标志物，其表达情况通常以阳性表达率来表示。在一项单臂Ⅱ期KEYNOTE-052临床试验中显示，在顺铂不耐受的晚期膀胱癌患者中，派姆单抗具有持久的临床反应，并与总生存期延长相关，尤其是在PD-L1高表达的患者中[23]。在一项多中心Ⅲ期IMvigor130临床试验中发现，与化疗相比，阿特珠单抗对不耐受顺铂治疗且PD-L1表达较高的晚期膀胱癌患者的总生存期有着显著改善[24]。以上研究不仅揭示了免疫抑制剂在晚期膀胱癌中的临床意义，而且确立了PD-L1作为膀胱癌免疫治疗生物标志物的地位。

在肿瘤的进程中，肿瘤细胞表面的PD-L1表达逐渐上升和T淋巴细胞表面的PD-1结合，是肿瘤细胞免疫逃逸的机制之一。从理论上来说，肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白表达越多，患者对PD-L1/PD-1抑制剂的疗效越好。但PD-L1的阴性预测价值相对较低。据报道，多达16%的PD-L1阴性的膀胱癌患者受益于ICI[9]。产生该现象的主要原因为：PD-L1检测方式、判定手段不一致，另外肿瘤组织内的时间和空间异质性以及PD-L1表达的不稳定性也会影响最终的检测结果；ICI不仅作用于T淋巴细胞，还可以调节肿瘤微环境中的其他细胞，并且对肿瘤基因突变负荷、特定基因的突变等都会产生影响；免疫系统是一个极其复杂的系统，即使是微小的差异也有可能产生截然不同的效益。因此，PD-L1单独的作为预测因素来指导膀胱癌患者的治疗显然不够充分。

3 液体活检相关的标志物

在免疫治疗过程中，外周血和其他血液标志物可以动态监测患者对ICI的反应性。例如，外周血树突状细胞升高与PD-L1通路负相关，可能参与膀胱癌患者的免疫逃逸[25]。有研究结果显示，通过从外周血中分离游离DNA(cfDNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)或循环肿瘤细胞(CTC)，可作为ICI反应的预后和预测标志物[26]。目前，已有大量研究证实膀胱癌中的液体活检生物标志物可以动态监测患者的预后、复发和药物反应等[27]。

液体活检在临床中简单易行、无需侵入性取样、可重复性高，并且不易受到肿瘤内异质性的影响，相信未来会有更大规模的研究及更新进的技术来提高液体活检的有效性和敏感度，进一步来监测膀胱癌的发生发展。

针对不同阶段的膀胱癌患者，免疫治疗不仅要考虑治疗的有效性，还要考虑治疗的安全性。随着精准医疗的发展，新的免疫治疗标志物的发现、检测手段的进步、新兴技术产生的大量数据以及极有可能联合多种生物标志物进行评分来指导免疫治疗等相关策略的出现，未来必定会有更细致、更准确的指导方案来规范免疫治疗，最终实现膀胱癌患者的个体化贯序治疗，减轻治疗过程中带来的痛苦以及改善患者的预后。