肝癌肿瘤微环境中CD8+细胞毒性T淋巴细胞的研究进展

张艾，李海洋

1 贵州医科大学临床医学院，贵阳 550004；2 贵州医科大学附属医院肝胆外科

肝细胞癌（HCC）简称肝癌，占原发性肝癌的90%，是全球第7 大常见癌症，亦是癌症相关死亡的第2 大常见原因［1-2］。我国是肝癌大国，肝癌位居我国癌症死因的第二位，亦是慢性肝病患者最常见的死亡原因［3］。乙肝病毒的慢性感染是全球肝癌发生的主要原因，其次是酗酒、丙肝病毒慢性感染、与代谢综合症相关的脂肪肝疾病，以及其他不常见可能会导致肝硬化的疾病，包括原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎和血色病等，最后是肝癌存在的重要环境危险因素，如含黄曲霉毒素B1的膳食等。目前针对肝癌治疗方法有手术切除、肝移植、射频消融、局部放化疗等，然而只有手术切除和肝移植是潜在的治愈方法，尽管多激酶抑制剂索拉非尼为代表的分子靶向治疗药物取得重大进展，但索拉非尼治疗肝癌的5 年生存率极低，晚期肝癌的预后仍较差。与常规治疗方法相比，肿瘤免疫疗法主要利用肿瘤微环境（TME）内外的免疫细胞对癌细胞进行特异性识别和攻击，理论上可使免疫疗法具有更高的特异性和更小的不良反应。作为典型的抗肿瘤首选免疫细胞，CD8+细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）以抗原特异性方式识别肿瘤细胞并分泌细胞毒物质介导肿瘤细胞凋亡。充分了解肝癌TME、CTL 特点和相互作用是免疫治疗成功的关键。现就肝癌TME 中CTL 的研究进展综述如下。

1 肝癌TME的作用

TME 是指围绕并滋养肿瘤细胞的组织环境，其特征是成分复杂，包括各种类型的免疫细胞、其他非转化细胞、分泌型分子、细胞外基质和血管等。TME在不同类型的癌症之间及在相同类型癌症的不同患者间存在较大差异。肿瘤细胞可动态改变其微环境，而微环境亦可影响肿瘤细胞的生长和扩散。适应性和先天性免疫系统的免疫细胞是TME 的主要成分，它们与肿瘤细胞建立动态相互作用，最终通过抑制免疫细胞的抗肿瘤活性促进肿瘤生长。这种现象亦发生于肝癌患者中。在生理情况下，肝脏具有丰富的免疫浸润细胞与非实质细胞，如肝窦内皮细胞（LEC）和库普弗细胞（KC）合作维持免疫抑制微环境，有利于对肠道抗原的自我耐受。病理情况下，肝癌的发生是复杂动态过程，包括三个阶段：起始、进展和转移。肝癌被细胞外基质和基质中的非癌细胞包围，TME 的生理状态与肝癌发生的每一阶段密切相关。几乎所有主要的肝癌相关肿瘤免疫细胞在肝癌TME 中有重要意义，包括髓源性抑制细胞（MDS）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、肿瘤相关中性粒细胞（TAN）、调节性T 细胞（Treg）、CTL、自然杀伤（NK）细胞、库普弗细胞（KC）、树突状（DC）细胞等［4］。

肝癌具有独特的TME，在肿瘤起始阶段可激发免疫反应防止肿瘤发生。诸多免疫抑制机制，包括免疫抑制细胞群在肿瘤内积累、抗原呈递缺陷和多种抑制性受体—配体通路的激活，均有利于形成免疫耐受，并促进肝癌进展。TME 中免疫抑制的程度与肝癌患者的不良预后密切相关。免疫细胞是肝癌进展的关键参与者，它们的募集和功能受到TME 的影响，是决定肿瘤命运及其侵袭和转移能力的基础。肿瘤相关免疫细胞可分为两种类型：抗肿瘤和促肿瘤免疫细胞。两种类型的细胞在肿瘤进展的不同阶段发挥不同作用。作为典型的抗肿瘤免疫细胞，CTL 通过其识别和消除肿瘤细胞的能力在抗肿瘤免疫中发挥重要作用，CTL 是针对肿瘤（包括肝癌）的特异性细胞免疫的最重要执行者，尤其是肿瘤细胞巢中的CTL 发挥主导作用。目前，多数针对免疫疗法的研究广泛关注增强CTL的细胞毒活性。

2 肝癌TME中CTL的功能

CTL 是用于靶向治疗癌症的首选免疫细胞，来源于T 细胞分化的效应CD8+αβT 细胞，细胞毒性是CTL 的主要功能。CTL 在破坏病毒感染细胞和癌细胞方面发挥主要作用。幼稚CD8+T 细胞通过CCR7再循环或CCR4/5 等趋化因子的作用被招募到引流淋巴结（dLN），未成熟的树突状细胞对肿瘤抗原进行采样后，以CCR7和XCR1趋化因子受体依赖性方式迁移到引流淋巴结并将抗原通过CD8+T细胞表面的TCR 呈递给幼稚CD8+T 细胞，树突状细胞和CD8+T 细胞间的相互作用以受体—配体相关方式介导，CD8+T 细胞表面受体共刺激分子CD27 和CD28分别与抗原呈递细胞上的配体B7 分子产生共刺激信号激活T 细胞受体（TCR）导致CD8+T 细胞增殖和活化成为CTL，CTL 下调归巢受体CCR7 并上调BLT1、CXCR3、CCR5 和CX3CR1 等趋化因子受体，迁移至TME，导致肿瘤细胞凋亡［5］。

CTL介导的肿瘤细胞凋亡机制主要有两种。一种是在肿瘤细胞识别时诱导的脱胞粒作用。CTL通过TCR 识别由主要组织相容性复合体I 类分子（MHC-I）呈递在肿瘤细胞表面的外源或修饰的特定抗原肽，触发信号分子在CTL 和靶细胞之间的形成的免疫突触，通过TCR 激活CTL 内钙的增加和分泌性溶酶体向免疫突触的极化，淋巴细胞功能相关抗原-1 和CD103 整合素等主要黏附和共刺激分子在CTL 上分别通过与其同源配体、细胞间黏附分子1（或CD54）和E-钙黏蛋白相互作用，并在免疫突触处将裂解颗粒的胞吐作用引导至肿瘤细胞表面，最终通过分泌型溶酶体向肿瘤细胞释放细胞毒性物质，如可溶性的颗粒酶B、穿孔素等，穿孔素在靶细胞的膜上产生孔洞，颗粒酶B 通过孔洞进入启动各种凋亡途径［6］。TAMZALIT 等［7］发现，即使在无穿孔素的情况下，CTL亦可通过机械运动介导肿瘤细胞凋亡。另一种机制是通过细胞表面受体的结合激活肿瘤细胞的自我凋亡过程。此外，CTL 还可通过分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α，独立于MHC的机制，间接攻击肿瘤细胞，在不影响体内其他细胞的情况下杀死肿瘤细胞。CTL 在介导肿瘤细胞凋亡后，会寻找临近的肿瘤细胞继续介导其凋亡，CTL 是典型的抗肿瘤免疫细胞，在抗肿瘤免疫中起关键作用。然而，在肝癌免疫抑制性TME 和延长肿瘤抗原暴露的背景下，肿瘤特异性CTL 容易分化为称为“T 细胞耗竭”的阶段。耗竭的CTL 不同于具有功能性的效应和记忆CTL，表现为细胞因子产生能力（IL-2、TNF-α 和IFNγ 等）和杀伤能力的不同程度丧失，细胞增殖受损，细胞毒活性降低，关键转录因子的表达和使用改变，代谢紊乱，尤其是多种抑制性受体的持续上调和共表达等［8］。耗竭的CTL 作为小鼠和人类的独特细胞谱系出现，其特征就是抑制性受体的高表达，如PD-1、TIGIT、TIM-3 和LAG-3 等免疫检查点分子［9］，耗竭的CTL表达的免疫抑制受体强度和数量与CTL衰竭的严重程度呈正相关。WANG 等［10］发现，在肝癌TME 中CTL 表达上调的胸腺细胞选择相关的高迁移率族框蛋白（TOX）调节PD1 的内吞循环，促进CTL耗竭影响肝癌进展。

3 肝癌TME成分对CTL功能的影响

肝癌TME 中CTL 的存在与改善肝癌的存活率相关，而TME 成分对CTL 的影响是肝癌抗肿瘤免疫的关键因素，微环境成分通过多种机制对CTL 介导的抗肿瘤免疫反应产生影响。肝纤维化是肝癌的一个突出特征，会削弱CTL对血小板衍生的CD44的识别，减少CTL 的浸润和黏附在肝窦上所进行的免疫监视［11］。就肝癌TME 中细胞成分而言，CTL 与抗肿瘤免疫细胞具有正串扰作用，而与促肿瘤免疫细胞具有负串扰作用。髓源性抑制细胞是起源于骨髓的异质性未成熟骨髓细胞群，在病理条件下扩增并上调免疫抑制因子的表达，是肝癌微环境中重要的促肿瘤细胞。ZHOU 等［12］发现，肝癌TME 中髓源性抑制细胞能够有效抑制CTL 增殖和功能。此外，髓源性抑制细胞表达的凝集素Galectin-9 可和CTL 高表达的免疫抑制受体TIM-3 结合，诱导CTL 凋亡。肿瘤相关巨噬细胞包括组织驻留巨噬细胞和由炎症刺激动员的骨髓来源的单核细胞衍生的巨噬细胞，具有抗肿瘤M1 和促肿瘤M2 两种极化表型。调节性T细胞可由外周血T 淋巴细胞、常驻T 细胞和其他细胞分化而来，是肝癌主要的促肿瘤免疫细胞。调节性T 细胞抑制肿瘤相关抗原呈递，且能通过抑制颗粒酶和穿孔素的产生和释放来削弱CTL 的杀伤能力，同时选择性地抑制CTL分泌的细胞分子（如IFNγ、TNF-α 等）。YANG 等［13］发现，调节性T 细胞表达可溶性纤维蛋白原样蛋白2通过减弱树突状细胞介导的CTL活性促进肝癌生长。

作为先天性免疫系统的主要免疫调节细胞，NK细胞具有细胞毒功能，可以直接杀死肿瘤细胞而无需抗原致敏，在抗肿瘤免疫中和CTL具有协同作用。库普弗细胞（KCs）是维持肝脏免疫稳态的重要组成部分，是人类肝癌微环境中主要表达B7-H1的细胞，并通过B7-H1 与耗竭的CTL 上的PD-1 相互作用介导细胞毒功能下降。CD4+T 淋巴细胞是CTL 反应的辅助细胞。CD4+T 淋巴细胞参与调节抗肿瘤免疫与CTL的启动有关，通过分泌细胞因子（如IFN-γ）激活抗原呈递细胞和主要组织相容性复合物I 类分子（MHC-I）增强抗原呈递作用，优化CTL 的细胞毒性分子表达、抑制性受体的下调和迁移能力的增加［14］。除了肝癌TME 中的经典免疫细胞外，其他成分亦严重操纵CTL功能。肝癌细胞亦能通过表达的精氨酸酶剥夺CTL的精氨酸和CTL形成严重的代谢竞争，进而抑制肿瘤特异性CTL 反应。SHAO 等［15］研究发现，人类肝癌细胞中过表达的转录调节因子CHD4/NuRD 复合物和抗肿瘤免疫反应中的关键免疫CTL和树突状细胞浸润呈负相关。以及物理条件如乳酸、低pH、缺氧等都会限制肿瘤相关抗原特异性CTL 反应［16］。HAN 等［17］研究提示，肝癌免疫调节细胞CD14+CTLA-4+调节性树突状细胞，可通过IL-10 和IDO 的产生抑制CTL 反应。JIN 等［18］在小鼠肝癌模型中发现，来自上皮细胞和免疫细胞释放的IL-33 可促进活化和效应CTL 的百分比和数量增加，上调CTL 的IFN-γ 产生，增强CTL 的细胞毒性，进而产生抗肿瘤效应。此外，抑制肿瘤CCRK 或肝脏IL-6会增加CTL 浸润和致瘤性受损，并通过髓源性抑制细胞的恢复而恢复，肿瘤CCRK 耗竭上调PD-L1 表达，增加瘤内CD8+T 细胞表达，从而增强PD-L1 阻断肝癌的作用［19］。

4 基于CTL的肝癌免疫治疗进展

在癌症免疫治疗中，体内肿瘤细胞主要被CTL或NK 细胞杀死，CTL 还具有杀死对NK 细胞具有抗性的肿瘤细胞的能力，而调节性T 细胞和髓源性抑制细胞可抑制抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤生长和转移。因此，肝癌免疫治疗旨在通过直接或间接的干预增强CTL 的持久反应或抑制调节性T 细胞和髓源性抑制细胞的作用。而CTL的募集和重新激活被认为是癌症的关键治疗策略。目前已尝试开发的诸多免疫治疗方法主要目的之一在于增强CTL 反应，包括肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂、过继性T细胞疗法等。肿瘤疫苗和过继性T细胞疗法是肝癌的传统免疫疗法，免疫检查点抑制剂是针对肝癌新的免疫治疗方法。

4.1 肿瘤疫苗 肿瘤抗原是一系列在肿瘤细胞中突变、异常或特异性表达的具有免疫原性的自我衍生的蛋白质，包括肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。基于肿瘤抗原的疫苗包括全裂解物疫苗、肽疫苗和树突细胞疫苗等，全裂解物疫苗和树突细胞疫苗作用有限，目前肿瘤疫苗开发的重点是肽疫苗。肽疫苗是基于肿瘤相关抗原的氨基酸序列，可直接刺激CTL的激活，从而识别特定的肿瘤相关抗原，杀死肿瘤相关抗原阳性的癌细胞。肽疫苗具有肿瘤特异性、毒性较小且效果持久，因此是一种有潜力的新的免疫治疗方式。肝癌免疫治疗成功的先决条件之一是确定在肝癌组织中具有专门或优先表达的肝癌相关抗原，并且证实这些肿瘤相关抗原的衍生表位具有强免疫原性。AKAZAWA 等［20］通过临床试验发现基于肿瘤相关抗原GPC3 的肽疫苗接种对晚期肝癌具有显著抗肿瘤作用，可使肝癌患者获得更长的生存期。δ-Catenin 肽疫苗可以刺激CTL 的激活并增强CTL 对肿瘤的浸润，还可增强IFN-γ 的分泌和CTL 对肿瘤细胞的杀伤能力［21］。ZHANG 等［22］研究发现，人类肿瘤排斥抗原Survivin 作为一种新发现的肿瘤相关抗原，在HLA-A2 限制性存活蛋白肽脉冲T2细胞的多重刺激诱导下，来自健康供体的外周血单核细胞的存活蛋白衍生肽特异性CTL表现出对表达存活蛋白的HLA-A2+肝细胞癌细胞的特异性裂解存活。由于在我国肝细胞癌患者HLA-A2 等位基因患者比例高于其他等位基因，患者Survivin 肽表位可能是HLA-A2+肝细胞癌患者特异性免疫治疗的潜在靶点。

4.2 免疫检查点抑制剂 近年来，免疫检查点抑制剂已成为癌症治疗中一种有前途的治疗方法。免疫检查点是一种特定的膜结合分子亚型，可作为癌症免疫逃逸的关键调节剂。免疫检查点抑制剂主要的抗肿瘤机制就是通过阻断共抑制通路重新激活预先存在的衰竭CTL，即使在弥漫转移的癌症中，免疫检查点抑制剂也可能导致长期的肿瘤消退。肝癌中研究最多的免疫检查点包括程序性死亡蛋白1及其配体（PD-1、PD-L1）、细胞毒性T淋巴细胞蛋白4（CTLA-4）、淋巴细胞激活基因3蛋白（LAG-3）和黏蛋白包含域的分子3（Tim-3）等。肝癌TME中，PD-1和PD-L分别在CTL和肝癌细胞上大量上调。PD-1和PD-L1相互作用的阻断可增强CTL增殖和IFN-γ分泌，还可以恢复耗竭的CTL 攻击肿瘤的能力［23］。目前PD-1 和PD-L1 相互作用的阻断已成为肝癌标准免疫疗法的一部分。细胞毒性T 淋巴细胞蛋白4（CTLA-4）是一种抑制性共受体，由活化的T细胞表达并组成性存在于调节性T细胞上，它通过与共刺激分子CD28 竞争共享配体（CD80 和CD86）来调节T 细胞活化。在肝癌和许多其他类型的癌症中，CTLA-4会抑制经过肿瘤相关抗原识别和分化的CTL的增殖［24］。CTLA-4阻断在肝癌免疫治疗中有重要意义。

4.3 过继性T 细胞疗法（ACT） 近年来，ACT 发展迅速，包括CAR-T、TCR-T、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）在内的ACT 疗法在血液肿瘤中意义重大，在实体瘤中的应用疗效尚不确切，最主要的问题就是转移后T细胞会衰竭和死亡。但鉴于ACT疗法有潜力提供持久的抗肿瘤免疫反应，在治疗肝癌的免疫疗法探索和发展依然引起关注。现阶段，在临床试验中，通过体外人工干预，CTL可以被赋予对抗肿瘤的能力，CTL通过破坏肿瘤细胞在过继细胞疗法中发挥关键作用。CTL过继疗法，包括基于TCR工程和基于嵌合抗原受体（CAR）的ACT疗法，绕过CTL介导的抗肿瘤免疫的所有步骤，直接将活化的CTL募集到肿瘤中，具有抗肿瘤功效。TCR 基因赋予CTL肿瘤特异性反应，通过TCR基因工程修饰的CTL遇到肿瘤细胞MHC上呈递的肿瘤抗原肽片段时，会发生基于免疫受体酪氨酸的激活基序的磷酸化，随后发生细胞内信号级联反应，导致CTL释放细胞因子和细胞毒性物质，介导肿瘤细胞凋亡。相比而言，基于嵌合抗原受体（CAR）的CTL在肝癌治疗中更具有临床应用前景。如GPC3特异性CAR-T细胞就可用于治疗肝细胞癌［25］，其在体外和体内均显示出显著抗肿瘤活性。

综上所述，CTL 是肝癌中主要的抗肿瘤效应细胞，激发CTL 反应是肝癌抗肿瘤免疫疗法的关键策略。目前，肝癌肿瘤疫苗的研究主要集中在开发个性化疫苗和寻找新的高表达或特异性表达的肿瘤抗原作为靶点。在目前情况下，优化肝癌免疫系统的治疗潜力在于依赖不同免疫疗法的组合协同增强抗肿瘤CTL 反应，此外需要特别注意的是基于CTL 的免疫疗法只能作为传统治疗方法的补充，目前肝癌治疗仍然首选传统治疗方法。