兔出血症病毒2型检测技术的研究进展

肖 璐，邬旭龙，王 印，江地科，张鹏飞，杨 蓉

（1.四川省畜牧科学研究院，动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066；2.成都农业科技职业学院畜牧兽医学院，宠物营养与健康研究中心，四川 成都 611130；3.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；4.四川省夹江县动物疫病预防控制中心，四川 夹江 614100）

兔出血症（RHD）又称“兔瘟”，是由嵌杯病毒科（Caliciviridae）兔病毒属（Lagovirus）的兔出血症病毒（RHDV）感染后，引起家兔的一种急性、高传染性、高致死性疫病［1］。RHDV 经典毒株于1984年在我国江苏首次报道［2］，2010年法国首次报道RHDV 的新型变异毒株［3］，将其命名为RHDV2，此后，多个国家相继报道了RHDV2的传播与流行。RHDV2与经典毒株的不同之处在于：自然条件下RHDV2 能感染不同年龄阶段的兔群，包括乳兔、幼兔及成年兔；感染范围更广，能感染家兔和野兔；此外，RHDV2 的致死率较经典株稍低［4］，但其发病速度更快。

2020 年4 月，我国首次报道四川某兔场确诊一起RHDV2 病例［5］，为我国养兔业敲响了警钟。由于目前尚无有效的RHDV2 疫苗和治疗措施，为了阻止疫情在国内蔓延及波及邻国养兔业安全，需及时筛查阳性病原，扑杀感染动物，阻断疫情传播。本文概述了近年来国内外RHDV2检测方法和诊断技术的研究进展，旨在为RHDV2 的早诊、监测和控制提供科学依据。

1 病原学检测技术

1.1 实时荧光定量PCR 该技术通过在普通PCR 技术的基础上加入荧光标记探针或荧光染料实现核酸的定量检测，与传统PCR 技术相比，实时荧光定量PCR 技术更快速、灵敏，结果更加直观且不用进行凝胶电泳等繁琐操作，更加便捷、准确和安全，因此，该技术被广泛地应用于RHDV2 的监测或者家兔恢复期RHDV2 的监测。王波［6］根据RHDV2 VP60 基因序列，利用SYBR Green I 技术，建立了一种RHDV2 的SYBR Green I 荧光定量PCR 检测方法，该方法特异、灵敏，经换算，其最低检测限度可达68 拷贝/μL。Duarte 等［7］也基于VP60 基因设计特异性引物和探针，建立了一种RHDV2 的Taqman 荧光定量PCR，该方法的重复性和重现性都较高，其组间变异系数低于2.4%，最低检测限度可达9 拷贝/μL。Fitzner 等［8］利用Taqman 荧光定量PCR 成功在兔子肝脏中检测到波兰地区的首例RHDV2。Camacho等［9］利用该方法对采自西班牙南部96个地区的190份病死野兔样品进行了RHDV2检测，结果其阳性检出率达到了97.4%（185/190），表明RHDV2在西班牙地区传播广泛。

1.2 RT-PCR 普通RT-PCR 检测方法的普适性更强，适用于多数实验室。杨泽晓等［10］根据RHDV 和RHDV2 VP60 基因中的保守片段设计特异性鉴别引物，建立了可区分RHDV和RHDV2的复合型RT-PCR，其对RHDV2的最低检测限度达到230拷贝/μL。Harcourt 等［11］利用PCR 对195份采自英国地区的宠物兔肝脏进行了RHDV 和RHDV2 检测，结合病理学观察结果，共计检出188份阳性样品，阳性率达96.4%（188/195），所有样品均为单一感染，未发现RHDV 和RHDV2 的混合感染，其中RHDV2 的阳性率达到66.5%（125/188），高于经典毒株的阳性率，可见RHDV2已取代经典毒株成为英国宠物兔身上的新流行毒株。Hall 等［12］开发了一种可以鉴别诊断GI.1c（RHDV）、GI.2（RHDV2）、GI.1a-K5、GI.1a-Aus 4种不同基因型RHDV 的多重RT-PCR，该方法对RHDV2的最低检测灵敏度可达10拷贝/μL。

1.3 其他病原学检测技术 Yang 等［13］基于环介导等温扩增技术（LAMP），选择RHDV2 VP60 基因的保守序列进行引物设计，通过反应条件优化，建立了RHDV2 的RT-LAMP 检测方法，该方法特异、灵敏、快速、成本低，可通过肉眼判读检测结果，其最低检测限度可达到180 拷贝/μL，适用于RHDV2 的快速检测。Miao 等［14］利用电子显微镜（EM），采用“点滴法”对纯化的RHDV2 病毒样颗粒进行电镜观察，发现病毒是直径约为30 nm 的球形颗粒，形态类似于RHDV，该方法可在其他方法得出可疑结果时作为RHDV2诊断的补充方法。最适合进行RHDV2鉴定的电镜方法是免疫电镜技术（IEM），该方法可以用兔抗RHDV2 高免血清（兔或其他动物）或单克隆抗体（MAb）与相应抗原进行检测，能提升正确鉴定病毒粒子和病毒蛋白的准确度。

2 血清学检测技术

2.1 酶联免疫吸附技术 酶联免疫吸附技术（ELISA）是一种可以检测RHDV2 抗原或抗体的技术，也是实验室最常用的检测技术，是国际贸易和OIE 所推荐的检测方法。Baratelli 等［15］为了研究RHDV2灭活疫苗是否能有效地传递给免疫种兔的后代，通过竞争ELISA 和固相ELISA 检测该病毒的抗体水平情况，结果显示RHDV2 抗体在育种过程中可持续长达一年之久，其母源抗体可以持续28 d，由此分析获知RHDV2可能主要是通过胎盘机制传播。Dalton 等［16］使用RHDV2 特异性单克隆抗体进行抗原捕捉和羊抗RHDV2制备，采用夹心ELISA 技术对兔肝脏中的抗原进行检测，结果显示该ELISA 灵敏度接近100%，能成功检测RHDV2 和RHDV2 重组病毒体，与RHDV G1 病毒未产生交叉反应，具有较好的重复性，最低检测浓度为6 ng/mL。Strive 等［17］使用RHDV2特异性单克隆抗体与澳大利亚病毒（RHDV，RHDV2 和两株不同的RHDVa）抗原相结合对竞争ELISA 进行调整，RHDV2 的IgA 和IgM 同型实验比原来RHDV的滴度提高了4倍。孔德生［18］使用原核表达技术进行RHDV2表达和单克隆抗体的制备，最后将纯化的蛋白包被于酶标板，然后进行抗RHDV2 单克隆抗体的杂交瘤细胞筛选，筛选到4 株能够识别RHDV2 的单抗株。ELISA可以在病毒感染早期进行病原检测，或对后期疫苗免疫后的抗体水平进行监测。

2.2 胶体金免疫层析技术 胶体金免疫层析技术（GICT）是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型免疫标记技术，近年来已应用于各种动物疫病抗原和抗体的快速检测，该方法操作简单、快速、灵敏，且不需要其他昂贵仪器，可在10 min 内完成检测，非常适用于基层工作者和养殖场的全场普筛，目前该技术用于检测RHDV 的较多。周丽军［19］将RHDV VP60截段蛋白包被于金标垫，用兔抗重组多克隆抗体标记C线，以HRP羊抗兔IgG标记T线，建立了RHDV的胶体金检测方法，临床样品阳性检出率为97.4%（150/154）。武玉香等［20］将VP60-2F4单克隆抗体包被于金标垫，VP60-9D4 和羊抗鼠分别作为检测线（T 线）和质控线（C 线），进行临床样品（100份）检测，结果与红细胞凝集试验（HA）结果一致，并且与兔巴氏杆菌、大肠杆菌、兔球虫、新城疫、猪瘟病毒等无交叉反应。GICT技术不仅可以检测血清，还可检测抗原，其生产成本较低，检测时间较短，在未来开发RHDV2 检测技术时可将该方法作为备用方法之一。

2.3 免疫印迹技术 免疫印迹技术（WB）是在SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫测定技术基础上发展起来的一种新型免疫生化技术，在HA、ELISA 等试验出现可疑结果或怀疑样品中有RHDV2 存在时，可利用该技术进行最终诊断。Kong 等［21］利用杆状病毒表达系统进行RHDV2 VP60 的表达与纯化，以单克隆抗体作为一抗，HRP 羊抗鼠作为二抗进行WB 验证，结果显示有两种单克隆抗体可以与RHDV2 VP60 反应，但这两种单抗是否能够用于临床样品检测还需验证。Qi等［22］利用pFastBac 双重表达载体，分别表达了经典RHDV 和RHDV2 的VP60 基因。通过IFA 和蛋白免疫印迹分析，发现重组VP60 蛋白在感染SF9 细胞中能够有效表达，且在72 h 时重组蛋白的表达水平最高，96 h 之后开始下降。WB 技术一般用于验证目的蛋白产生抗体是否具有反应原性，在蛋白表达及纯化中我们都加入相应蛋白标签，最后通过检测标签判定是否是目的蛋白。该技术常与IFA 技术结合，通过荧光增强效应和底物显色来确定目的蛋白所产生的抗体。

3 讨论与结论

养兔业是我国畜牧业的重要组成部分，四川是全国最大的养兔大省，2019年兔出栏量占到了全国的39.66%，养兔业是全省畜牧业发展的重要支柱产业之一，在养殖业中具有不可替代的地位。RHDV2 作为一种新型兔瘟病毒，在国内于2020 年4 月首发于四川省金堂县，导致感染场死亡率达60%以上，与RHDV 相比，RHDV2 的传播速度更快、传染性更强、感染宿主范围更广，且RHDV 经典株的疫苗对RHDV2 几乎没有防控作用，给养兔业带来了极大的威胁。当前，四川已有多起该病毒存在的报道，似有扩散的趋势和风险，且当前仍无针对性疫苗进行有效防控。为避免RHDV2 的传播，迫切需要快速、准确、高效的检测手段。病毒分离是检测RHDV2 的金标准，但分离病毒耗时较长，难度较大，且该病毒在体外尚无稳定的细胞材料，导致该方法不适用于疾病快速检测，在此基础上核酸检测技术迅速崛起，类似于RT-PCR、RT-qPCR 等技术，可以对多种混合感染的病原进行检测，样品可以是唾液、组织或血液等。

目前暂无RHDV2 疫苗进行有效防控，无需进行疫苗毒和野毒区分，只需进行抗体检测就能判定兔群是否感染RHDV2，其中类似胶体金技术可供基层工作者使用，能快速确定病原，及时清除病原，切断传播途径，防止疫情扩散。ELISA技术在前期可对大量样品进行检测，后续疫苗上市后可对兔群的抗体水平进行监测。RT-PCR技术可以先进行RHDV2 的检测，确定样品为阳性后再通过全基因组测序、基因比对、进化树分析等技术确定毒株的基因型和溯源，为接下来的防控做准备。