藏药材柳兰质量标准研究

张金魁 林鹏程 王 敏 范莹莹

(1.青海民族大学 药学院,西宁 810007;2.天津大学 管理与经济学部,天津 300072;3.青海省青藏高原植物化学重点实验室,西宁 810007;4.青海省药品检验检测院,西宁 810007)

柳兰系常用藏药材,藏文名恰班曲孜或恰班曲孜协贝吾投毛弄,是柳叶菜科(Onagraceae)柳兰属(Epilobium)植物柳兰(EpilobiumangustifoliumL.)的干燥全草.柳兰又名糯芋(云南丽江)、铁筷子(四川)、火烧兰(云南丽江)等,分布广泛,资源丰富.各地藏医以柳兰入药的品种较多,主要有柳叶菜科植物柳兰、沼生柳叶菜、圆柱柳叶菜等[1-4].本药味酸,性凉,具有利尿消肿和清热利胆功能,藏医主治“赤巴”热、胆囊炎、热性腹泻、排尿困难症及肠道寄生虫疾病[5-7],柳兰同时也是傈僳族常用药材[8-11].

柳兰药材在藏药中用量大,但一直以来缺乏该药材相应质量标准.《中国药典》、《中华人民共和国卫生部部颁藏药标准》、六省区共同编制的《藏药标准》、《青海省藏药标准》均未收载此药,为该药的鉴别、质量控制、炮制应用和进一步开发都带来了一定的困难.因此研究制定该药材的质量标准具有重要的现实意义.

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200 高效液相色谱仪,包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(美国Agilent公司);旋转蒸发仪Buchi Rotavapor R-205(瑞士Buchi公司);KQ-300B 超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);PL202-L100电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);全自动薄层点样仪.

1.2 药物与试剂

金丝桃苷对照品购自中国药品生物制品检定所(批号:111521-201708),乙腈(色谱纯,山东禹王),95%乙醇(分析纯,天津市富宇精细化工有限公司),乙酸乙酯、甲酸(分析纯,天津市大茂化学试剂厂),水为超纯水(自制).GF254型薄层硅胶板(青岛海洋化工厂);于2007年8-9月采集青海、西藏、甘肃、四川不同产地及来源的柳兰药材共计13批,经青海民族大学药学院林鹏程教授鉴定,为柳叶菜科柳叶菜属植物柳兰,样品阴干、粉碎,过80目筛,冷藏保存.具体采集地及来源见表1.

表1 柳兰药材来源

2 方法与结果

2.1 性状鉴别

本品根茎呈圆柱形,长短不等,直径0.5～1.5 cm,表面棕褐色,栓皮具纵皱纹,有芽痕和侧芽痕,顶端呈疙瘩状,残留有数个茎基;茎圆柱形,中空,长32～65cm,基部和上部带暗紫色;叶多皱缩、破碎,展开后呈披针形,长6～15cm,宽1～2.5cm,叶面暗绿色,叶背灰白色;总状花序,花瓣4,倒卵形,先端钝圆,长约1cm,紫色;气微,味酸、微苦[9,12].

2.2 显微鉴别

柳兰根横切面皮层、木栓层、木质部和髓细胞四界分明,形成层明显,木质部宽广.表皮细胞3～5列,细胞长方形,呈淡黄色;皮层细胞多列,细胞排列紧密,类长条形,少数细胞中含草酸钙针晶;木射线细胞1列,导管散在;髓部明显、中空,细胞中富含草酸钙针晶束.结果如图1所示.

图1 柳兰根横切面组织结构显微特征图

本品粉末浅绿色,粉末鉴别观察到6种结构,分别为非腺毛、花粉粒、叶上表皮细胞、气孔、木栓细胞、草酸钙针晶.草酸钙针晶散在或成束,长约120μm;导管多为螺纹导管,直径约30μm;叶表皮细胞,细胞多长圆形,排列较整齐,气孔不等式;种皮细胞长圆形,排列较整齐,直径约10～15μm;花粉粒圆球形,直径约115μm,有2～3个萌发孔.结果如图2所示.

图2 柳兰粉末显微特征图

2.3 薄层鉴别

2.3.1 样品溶液的制备

取本品粉末1.0g,加入60%乙醇50mL,超声提取60min,过滤,减压浓缩至干,加25mL 蒸馏水溶解,用50mL 乙酸乙酯萃取,将水相浓缩至干,用10mL甲醇溶解作为供试品溶液.另取金丝桃苷对照品,加甲醇制成每1mL含1.25mg的溶液,作为对照品溶液.

2.3.2 薄层色谱条件

依照薄层色谱法(《中国药典》四部通则)试验,吸取样品18μL、对照品5μL,分别点于同一硅胶G 薄层板上,以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)的溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷3% AlCl3乙醇溶液显色,365nm 紫外灯下观察.供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点.如图3所示.

图3 柳兰TLC图

2.4 检查

按照《中国药典》2020年版水分测定法(烘干法,通则0832)、灰分测定法(通则2302)、浸出物测定法(热浸法,通则2201),对13批柳兰药材进行测定,每份药材重复3次实验,见表2.

表2 柳兰药材水分质量分数测定

综合实验结果,13 批柳兰药材的含水量在4.49%～5.87%之间,平均值为5.29%;总灰分在3.47%～4.55%之间,平均值为4.00%;酸不溶性灰分在0.11%～0.24%之间,平均值为0.17%;醇溶性浸出物在17.37%～30.26%之间,平均值为21.12%.以不合格率低于样本量的20%进行限量,建议柳兰药材水分不得超过12.00%,总灰分不得超过10.00%,酸不溶性灰分不得超过2.00%,醇溶性浸出物不得少于25.00%.

2.5 重金属含量测定(《中国药典》四部通则)

2.5.1 供试品的制备

准确称取1～13号柳兰样品粉末各0.25g,置于13个消解罐中,加10mL浓HNO3,预消解过夜后进行微波消解,消解程序(时间:0-30-50min,温度25-180-180℃).将消解罐置于赶酸仪中,至剩余溶液体积不超0.5mL,将其转移至50mL容量瓶中,用超纯水洗涤消解罐,并转移至容量瓶中,加水定容至刻度,待测.同法制备空白试验溶液,每份供试品平行3次.

2.5.2 检测方法

铜元素用ICP-OES法测定,砷、汞元素用原子荧光光谱仪测定,铅、镉元素用原子吸收光谱仪测定.

对13批不同产地柳兰中重金属的含量进行了测定,结果见表3.由表3可知,上述13批不同产地柳兰中重金属含量均符合国家限量标准.

表3 重金属含量测定结果 (单位:mg/kg)

2.6 含量测定

2.6.1 供试品溶液及对照品溶液的制备

供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入60%乙醇25ml,称定重量,加热回流1h,放冷,再称定重量,用60%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得.

对照品溶液的制备:取金丝桃苷对照品适量,精密称定,加60%乙醇制成每1ml含50μg的溶液,即得.

2.6.2 色谱条件及方法

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-水为流动相;检测波长为360nm.分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定.

2.6.3 方法学考察

1)线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液(0.1mg/mL)5、10、15、20、25μL,按上述条件分别注入色谱仪测定,以进样量对峰面积进行回归,得回归方程y=1320.5x-98.29,r=0.9999,金丝桃苷在0.5～2.5μg范围内线性关系良好,结果见表4和图4.

表4 线性关系考察

图4 对照品标准曲线图

2)精密度实验

取1号柳兰(青海泽库县)供试品溶液,在选定色谱条件下测定连续进样5次,记录金丝桃苷峰面积,计算得其峰面积RSD 为1.96%,表明仪器精密度良好.结果见表5.

表5 精密度试验结果

3)稳定性试验

取1号柳兰(青海泽库县)供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、12、24、48h 8个时间点在选定色谱条件下测定,记录金丝桃苷峰面积,计算得其峰面积RSD 为2.0%,表明柳兰样品溶液在10h内稳定.结果见表6.

表6 稳定性实验结果

4)重现性试验

按照上述含量测定方法对1号样品制备6份供试品,分别进样10μL,测得峰面积并计算含量.记录金丝桃苷峰面积,计算得其峰面积RSD 为1.89%,表明建立的液相分析方法重复性良好.结果见表7.

表7 重复性试验结果

5)加样回收率试验

取已知含量1号柳兰样品1.0g,9份,分成3组,分别按药材含量的80%,100%,120%添加对照品,按在选定色谱条件下测定,通过金丝桃苷峰面积,计算加标后各组柳兰样品中金丝桃苷含量,得金丝桃苷平均回收率为100.06%(n=9),RSD 为1.12%.结果见表8.

表8 加标回收率试验结果

2.6.4 样品含量测定

按上述含量测定方法,对13批样品进行含量测定,结果见表9.

表9 13个不同产地柳兰中金丝桃苷含量

含量测定结果显示:13批柳兰药材中金丝桃苷的含量平均值为1.950mg/g(0.1950%),按最低含量作为限度的制定幅度,建议柳兰按干燥品计算,金丝桃苷(C21H20O12)不得少于0.10%.

3 讨论

柳兰系藏族习用药材,为柳叶菜科植物柳兰EpilobiumangustifoliumL.的干燥全草.夏、秋两季采挖,洗净阴干入药.本文依据《中国药典》2020年版四部通则,分别从性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱鉴别对柳兰药材进行了定性鉴别,从水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物对柳兰药材进行了检查,以金丝桃苷为对照品进行了HPLC 含量测定,系统开展了藏药材柳兰的质量标准研究.综合评价不同产地及批次的13批样品结果,并考虑药材产地、采集季节、采收加工等多方因素,建议柳兰药材各检查指标水分不得超过12.00%,总灰分不得超过10.00%,酸不溶性灰分不得超过2.00%,醇溶性浸出物不得少于25.00%;由于常见重金属铅、砷、镉、汞、铜的含量测定结果均远低于国家限量标准,故不做限量要求;按柳兰药材干燥品计算,含金丝桃苷(C21H20O12)不得少于0.10%.

本研究填补了柳兰作为藏药材入药无相关质量标准的空白,所建立的定性鉴别和含量测定方法简便可行,所制定的质量标准可以用于柳兰药材的控制,为柳兰药材的质量控制及应用开发提供了参考依据.