基于超高效液相色谱－四极杆－静电场轨道离子阱质谱的羊乳脂肪球膜全蛋白谱泌乳期时序差异研究

张 荣，贾 玮，2*

（1．陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2．陕西农产品加工技术研究院，陕西 西安 710021）

随着人们膳食营养结构的完善和生活水平的提高，对乳制品市场的需求不断增加，同时，国家为促进奶业发展实施了一系列政策，使得羊乳市场进入快速成长期，成为国内乳品市场的一股新能量［1］。羊乳因脂肪颗粒小、微量元素及维生素含量高且不含牛乳中易致敏蛋白等特点，被认为是最接近母乳的乳品，也是现代人类的健康营养佳品［2］。随着羊乳产业的升级和加工技术的不断发展，对羊乳的营养功能成分研究也需要在现有基础上继续深入。

乳脂肪是羊乳的主要成分之一，以脂肪球的形式存在于乳体系中。乳脂肪球形成于乳腺分泌细胞中，首先在内质网膜表面合成前体，随后以微脂质滴的形式聚成大小约0.2～8 nm的球体，相互融合生长并通过细胞质到达细胞顶端，待从上皮细胞分泌出去时再包裹上一层等离子膜即乳脂肪球膜［3］。乳脂肪球膜结构复杂，主要由以糖蛋白为主的特异性膜蛋白质和以神经鞘脂类为主的磷脂组成［4］。乳脂肪球膜虽然在整个乳体系中占比很少，但具有重要的生物功能特性，如抗黏附性、抗菌、抗癌等，并且与肠道相关疾病、自闭症和多发性硬化症等疾病相关，同时也参与信号传导和细胞调节、凋亡、分化、生长等生物过程［5］。乳脂肪球膜中含有25%～60%的蛋白质，其中含量较高且具有显著生理活性功能的蛋白质有嗜乳脂蛋白（BTN）、黄嘌呤脱氢酶/氧化酶（XDH/XO）、血小板糖蛋白4（CD36）、脂肪酸结合蛋白（FABP）、脂滴包被蛋白-2（PLIN2）和黏蛋白-1（MUC1）等［6］。

乳脂肪球膜（MFGM）蛋白因结构特异和具有多重生物功能，越来越受到人们的关注［7］。研究发现母乳与牛乳中的MFGM蛋白存在较大差异，母乳中存在1 230种特异性蛋白质，且有24种蛋白质参与免疫相关的通路［8］，牦牛乳与牛乳中的主要乳脂肪球膜蛋白在相对丰度上虽有所不同，但其生物学功能几乎无差异［9］。同时非标记蛋白质组学技术结合MaxQuant软件及Andromeda搜索引擎，为蛋白质组学中的大多数定量实验提供了完整的解决方案［10］。

为了更好地了解不同泌乳期羊乳的MFGM蛋白质组成并评估其差异，本研究从羊初乳和羊常乳样品中分离提取MFGM蛋白，使用蛋白质组学技术与高分辨质谱技术结合MaxQuant软件对其种类和数量进行研究。随后使用偏最小二乘判别分析筛选并确证标志性特征蛋白质，使用基因本体论（Gene ontology，GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析评估了差异蛋白质的潜在生物活性功能，以便更好地了解羊乳MFGM蛋白质的组成，为今后羊乳的深加工及副产品加工提供方向。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

纳升级液相色谱系统（EASY-nLC 1000）串联四极杆－静电场轨道阱高分辨质谱仪、真空冷冻干燥机、酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）；Milli－Q Integral型纯水仪（美国Millipore公司）；AL204－IC型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

胰蛋白酶（测序级），甲酸、乙腈（色谱纯）（德国Dr.Ehrenstorfer公司）；BCA快速蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、Tris、尿素、碳酸氢铵（分析纯，美国Sigma公司）；10 kDa超滤管购自美国Millipore公司。

羊乳样品取自陕西省西安市的关中奶山羊养殖场，选取40只健康且没有急性乳腺炎和明显临床疾病的关中奶山羊，年龄为2～4岁。在2021年5月采集产后0～5天的羊乳初乳和产后1～6个月的羊乳常乳样品各20份，并于2～4 h内运送至实验室。分析前，将各个样本集各自混合以减少个体差异。

1.2 蛋白质的分离提取

量取50 mL羊初乳和50 mL羊常乳样品，在4℃下于12 000 r/min离心40 min获得乳脂肪层、乳清层和固体颗粒。将乳脂肪层转移至新的离心管并用磷酸盐缓冲液（PBS，0.1 mol/L，pH 6.8）超声洗涤15 min，在4℃下以12 000 r/min离心20 min。重复该洗涤过程3次。随后，用0.4%十二烷基硫酸钠超声洗涤乳脂肪层1 min，在4℃下以12 000 r/min离心20 min，收集MFGM蛋白。使用BCA快速蛋白定量试剂盒对不同泌乳期的羊乳MFGM蛋白质进行测定。

1.3 超滤辅助样品制备及消化

取100 μL提取的MFGM蛋白样品，加入10 μL 100 mmol/L二硫苏糖醇，于56℃下孵育1 h，以保持蛋白质巯基处于还原状态。冷却至室温后，加入碘乙酰胺至终浓度为55 mmol/L，在25℃下避光孵育30 min完成巯基烷基化。将孵育完成样品转移至10 kDa超滤离心管中，加入100 μL尿素缓冲液（150 mmol/L Tris HCl和8 mol/L尿素，pH 8.0）洗涤MFGM蛋白样品两次，随后加入100 μL 50 mmol/L碳酸氢铵溶液离心。取胰蛋白酶-50 mmol/L碳酸氢铵溶液，使酶与底物的质量比为1∶50，加入超滤离心管中，37℃下酶解12 h。加入1%甲酸终止消化，使用C18柱对样品酶解肽溶液进行脱盐冻干，以40 μL 0.1%甲酸复溶后进行质谱鉴定。

1.4 仪器条件

色谱条件：Hypersil Gold aQ C18反相色谱柱（100 mm×75 μm，3 μm，Thermo Fisher Scientific公司），流动相A：4 mmol/L甲酸铵水溶液（含0.1%甲酸），流动相B：4 mmol/L甲酸铵乙腈溶液（含0.1%甲酸）；流速：250 nL/min；进样量：5 μL；柱温：30℃；梯度洗脱程序：0～50 min，5%～35%B；50～95 min，35%～100%B；95～100 min，100%B；100～110.1 min，100%～5%B；110.1～120 min，5%B。

质谱条件：加热电喷雾离子源（HESI），鞘气流速48 L/min，辅助气流速5 L/min；喷雾电压3.8 kV；离子源温度350℃；毛细管温度300℃。在m/z300～1 700范围内采集所有数据信息，正离子模式下一级扫描的分辨率为70 000（m/z200的半峰宽），二级扫描的分辨率为17 500，最大离子注入时间为120 ms，在线性离子阱中对前20个响应最高的前体离子进行碎裂，隔离窗口为m/z2，碰撞能量高达27 eV。通过UniProtKB在线数据库下载羊的蛋白序列数据库，使用MaxQuant 1.6.7.0软件对二级实际谱图与肽段理论碎裂谱图进行匹配，以Andromeda为搜索引擎，并采用非标记定量（Label-free quantification，LFQ）算法进行相对定量分析。使用Target-decoy搜索策略调整肽段和蛋白质鉴定的阈值，使错误发现率在0.01。

2 结果与讨论

2.1 羊乳脂肪球膜全蛋白谱鉴定及表达差异分析

通过肽段在不同泌乳期的羊乳中鉴定出473种MFGM蛋白，并对419种蛋白实现了定量，其LFQ强度跨越近5个数量级，其中羊初乳中定量331种蛋白质，羊常乳中定量252种蛋白质。初乳中MFGM表达的蛋白种类远远高于常乳，说明初乳富含免疫球蛋白和生物活性蛋白，营养价值更为丰富。在鉴定出的MFGM蛋白中，羊初乳中含有包括6-磷酸果糖激酶、α-1-抗蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白和维生素D结合蛋白在内的167种特征表达蛋白，羊常乳中含有包括粘蛋白-15、脂滴包被蛋白-1、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3－1在内的88种特征表达蛋白，164种蛋白在这两组样品中共有表达（图1）。

图1 不同泌乳期羊乳MFGM蛋白的组成表达差异Fig.1 MFGM protein of goat milk at different lactation periods

对2组样品集的混合样品分别平行3次进样，得到的LFQ强度先进行均值归一化处理，将数据矩阵转换为高斯型分布，以消除3次平行分析之间离子强度的系统性偏差，使所鉴定蛋白丰度更具可比性［11］；随后进行单变量分析，分别以2和0.05为倍数变化及显著性差异的阈值，绘制双对数火山图，最终获得羊初乳和羊常乳样品中具有显著差异的蛋白质310种，其中羊初乳中上调蛋白质有131种，下调蛋白质有179种（图2）。不同泌乳期羊乳中鉴定出的特征蛋白质及共有蛋白质丰富了人们对于羊乳蛋白质成分的了解，为羊乳基婴幼儿乳粉和功能食品的研发及进一步的功能开发提供了有效的理论基础。

图2 不同泌乳期羊乳MFGM蛋白的火山图Fig.2 Volcano plot of goat milk MFGM protein at different lactation periods

2.2 不同泌乳期羊乳MFGM蛋白质的化学计量学分析

以筛选的具有显著性差异的蛋白质为基础，利用正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least－squares discrimination analysis，OPLS－DA）对羊初乳和羊常乳样品进行分析。2组样本的R2X为0.962，R2Y为0.992，Q2为0.999，表明所建立的模型具有良好的拟合能力和预测性能［12］。样品明显分开且各自聚集紧密（图3），表明羊初乳和羊常乳样品之间观察到的分布差异主要是由于生物学原因。选择VIP值大于1.2的蛋白为标志物进行后续研究（表1）。使用热图对羊初乳和羊常乳中鉴定的具有显著表达差异，同时满足VIP值大于1.2的MFGM蛋白质进行可视化分析。左边的每一个方格代表一种MFGM蛋白质，其颜色表示该蛋白表达的相对丰度，相对丰度越高颜色越深，红色代表上调，蓝色代表下调；右边为每种MFGM蛋白在Uniprot中的基因名称（图4）。在羊初乳和羊常乳样品中有47个显著差异的特征蛋白显示两个不同的趋势，其中羊初乳中的上调蛋白包括载脂蛋白E（APOE）、紫苏苷-2（PLIN2）、Ras相关蛋白18（RAB18）、多聚免疫球蛋白受体（PIGR）和黄嘌呤脱氢酶/氧化酶（XDH）等21种，下调蛋白包括EH结构域蛋白1（EHD1）、EH结构域蛋白4（EHD4）、Ras样原癌基因A（RALA）、跨膜蛋白263（TMEM263）等26种。

表1 羊初乳和常乳中显著表达的差异MFGM蛋白质（P＜0.05，fold change（FC）＞2，VIP＞1.2）Table 1 Significantly expressed proteins in colostrum and mature milk（P＜0.05，fold change（FC）＞2，VIP＞1.2）

图3 不同泌乳期羊乳的OPLS－DA分析图（n=3）Fig.3 OPLS－DA analysis diagram of goat milk at different lactation periods（n=3）

图4 不同泌乳期羊乳特征MFGM蛋白组成及表达差异Fig.4 Composition and expression difference of characteristic MFGM of goat milk at different lactation periods

APOE可调节免疫反应的激活和持续的炎症反应，从而在动脉粥样硬化中具有保护作用［13］。PLIN2主要分布在脂质滴表面，通过阻碍主要的三酰基甘油脂酶ATGL的相互作用保护脂滴免受脂解，对于哺乳期脂滴的代谢和分泌至关重要［14］。PIGR通过多聚免疫球蛋白A和免疫球蛋白M分子上的J链结合，进而介导PIGR的跨上皮细胞转运及分泌，发挥免疫球蛋白在粘膜屏障中的病原体清除作用，提高机体免疫力［15］。在哺乳动物中的XDH是复杂金属黄素蛋白质的基准物，可广泛催化醛类、嘧啶、嘌呤和喋呤的羟基化反应［16］。Ras相关蛋白是在活性鸟苷三磷酸（GTP）结合态和非活性鸟苷二磷酸（GDP）结合态之间循环的二元分子开关。这种转换机制在各种不同的GDP/GTP结合蛋白如细菌伸长因子、异三聚体G蛋白和多种具有不同生物学功能的小GTP酶中高度保守，其活性异常也可能在自闭症和其它神经系统疾病中发挥重要作用［17］。EH结构域蛋白是参与受体回收的关键适配器蛋白，可对一些关键的内吞事件进行功能调节，包括各种受体的内化和再循环，EHD1控制转铁蛋白受体、主要组织相容性复合体Ⅰ蛋白质和β-整合素等受体从内吞小泡到质膜的循环。同时，EHD1已被证明可协同促进有氧糖酵解［18］。

2.3 不同泌乳期羊乳MFGM蛋白质的生物信息学分析

使用DAVID数据库对羊初乳和羊常乳差异表达的MFGM蛋白质从生物过程、细胞成分和分子功能3大分支进行GO富集注释，各分支中最显著的富集注释信息见图5A～C。MFGM蛋白参与不同的生物学过程，其中，细胞过程、定位和生物调节为主要参与。另外，MFGM蛋白也在生物粘附、代谢过程和免疫过程中发挥作用，参与通路的蛋白质在泌乳期间的丰度变化可为不同阶段生长发育提供特定营养与保护。特征差异蛋白质所参与的代谢过程可调节婴儿肠道的结构和功能成熟［19］。MFGM蛋白主要富集在脂质微滴、细胞外间隙和细胞外囊泡等，说明初乳中的低丰度蛋白组分是血清中蛋白质在乳腺细胞的紧密连接处通过细胞外囊泡在细胞间或跨细胞传递到乳脂肪球膜中，进而参与行使关键生理功能［20］。这些蛋白在羊乳中的分子功能包括ATP依赖活性、结合作用、催化活性。为对羊初乳和羊常乳的差异表达MFGM蛋白生物学功能进行更深入分析，使用KEGG分析了MFGM蛋白所参与的主要通路，结果如图5D所示。图中显示了差异表达的MFGM蛋白参与的通路，表明趋化因子和细胞因子信号通路介导的炎症过程和整合素信号通路为主要参与通路。整合素从细胞外基质发出信号完成乳腺上皮细胞分化和羊乳合成［21］。趋化因子作用于免疫系统的细胞表面，招募细胞到损伤或感染位点，参与启动和调节急性组织损伤或代谢不平衡触发的炎性反应［22］，这也证实了羊初乳可在一定程度上降低机体炎症反应。半乳糖的代谢通过Leloir途径进行，首先由半乳糖变构酶将α-D-半乳糖异构化为β-D-半乳糖，然后由半乳糖激酶将β-D-半乳糖磷酸化。随后半乳糖-1-磷酸通过半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶将UDP葡萄糖转化为UDP半乳糖并释放葡萄糖-1-磷酸，UDP半乳糖通过UDP-半乳糖-4-差异构酶转化为UDP葡萄糖［23］，而羊初乳和羊常乳在调节半乳糖代谢方面存在差异。

图5 不同泌乳期羊乳蛋白GO功能注释和KEGG通路富集Fig.5 GO functional annotation and KEGG pathway enrichment of goat milk protein at different lactation periods

3 结论

本研究采用非标记蛋白质组学方法，对羊初乳和羊常乳的乳脂肪球膜蛋白质进行了研究。羊初乳和羊常乳中共定量419种MFGM蛋白，其中羊初乳中存在167种特征表达蛋白，羊常乳中有88种，164种蛋白在这两组样品中共有表达。通过单变量及多变量分析筛选出羊初乳和羊常乳样品中47个显著差异的特征蛋白。GO功能富集分析发现，所鉴定乳脂肪球膜蛋白质主要参与的生物过程是细胞过程、定位和生物调节，KEGG通路为趋化因子和细胞因子信号通路介导的炎症过程和整合素信号通路。为了充分利用羊乳的乳脂肪球膜营养保健功能，有必要进一步详细描述羊乳乳脂肪球膜中这些蛋白质的分子结构和相关的生物学功能。