基于微流控的植物根部-微生物相互作用研究进展

陈登博付玉明冯佳界

(1.北京航空航天大学生物与医学工程学院,北京 100191;2.北京航空航天大学空天生物技术与医学工程国际联合研究中心,北京 100191)

1 引言

植物栽培是地面和受控生态生命保障系统的重要组成部分。植物的根系有固定植株、吸收水分和养分等重要功能,根际微生物在植物根表或近根部位生长繁殖,是植物微生物组的重要组成部分。植物脱落物或分泌物可到达根际微区,在根系周围形成丰富而复杂的化学环境[1],是植物在长期进化过程中形成的一种适应外界环境变化的重要机制[2]。这些植物脱落物或分泌物为微生物提供营养,以此构建和调节根际微生物菌群[3];另一方面,根际微生物也会深度参与调解植物生理活动[4-5]。因此,植物与微生物的根际相互作用(简称根-菌互作)是植物学和微生物学研究的热点问题。传统的根-菌互作研究所用的栽培方式难以实时营造对根际研究所需化学环境,且由于需要将植物根部取出进行采样和成像观察,使得采样和成像不具有实时性(时间分辨率较低),难以复现动态的互作过程。并且根毛可增加根表面积,为根部探索更大空间,在根生理学研究中具有重要地位,但却因为尺度过小而难以采样和成像等。因此,根-菌相互作用的实时化、可视化和操控性研究是一项新的挑战。

近年来,控制小体积流体的微流控芯片技术(或称为芯片实验室)为生物学研究的实时化和可视化提供了新方法,在根-菌互作研究中展现出巨大潜力。微流控技术在根-菌互作研究中具有三大优势: ①透明的芯片可实现根-菌互作的实时成像; ②可实现对根际环境的多次采样; ③可对根际化学环境实现准确操控,以研究化学环境对互作的影响。目前最广泛采用的芯片构建流程及材料为:按照所需的芯片设计图纸,以光刻机制作与其互补的光刻胶材质或3D 打印制作塑料材质的模板(Template/mold),以聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)浇注到模板上成型后剥离,再以等离子体氧化PDMS 的需封装面(即有芯片通道的面)以活化其表面基团,最后放置玻璃片至封装面上键合以完成封装[6]。相对于二氧化硅、热固性塑料、热塑性塑料等其他可选的芯片材质,PDMS 的价格低廉、偏软质、制作模板后可快速批量浇注制取等优势,使其成为主流芯片制作流程中常用材料[6]。等离子体氧化封装方式是不可逆的,即封装后很难将PDMS 从玻璃片上拆卸;若实验有拆卸需求,可考虑可逆的封装方式,直接在室温下依赖PDMS 和玻璃片间的范德华力封装,但这样封装不严密,在外力和内压下容易因意外拆卸开[7]。

高等植物可以再生氧气、食物和水,是生物再生生命保障系统(Bioregenerative Life Support System,BLSS)的功能核心[8]。而空间特殊环境(微重力、辐射、磁场、密闭、微生物多样性受限等)对根-菌互作的影响尚不明晰,前期搭载实验表明植物对微生物病害的敏感性可能增加[9]。而微流控技术体积小、性价比高,对于空间研究也独具优势。本文综述了基于微流控的植物根部发育和根-菌互作的研究,阐述微流控芯片针对不同栽培基质的成像及对根际化学环境的操控/采样功能的优势,分析了芯片针对不同根系形态需求的研究,并对微流控技术在空间环境根-菌互作研究中的重要作用进行展望。

2 根-菌互作芯片的成像技术

主流微流控芯片的材质(PDMS、玻璃片等)透光性好,对根-菌互作的成像观察独具优势。若能结合荧光等生物发光技术和一些高级成像技术,将可以更全面地还原根-菌互作过程。

Massalha 等[10-11]构建的微流控系统TRIS(Tracking Root Interactions System)是一个研究根-菌互作的典型装置,如图1(a)所示,体现了生物荧光技术在芯片根-菌互作成像中的出色效果。TRIS 系统采用PDMS-玻璃片材质,在灌有固体植物培养基的移液器吸头中令拟南芥发苗,在根长出吸头前移栽至芯片通道入口令其向芯片中生长,并使用注射泵将液体培养基和所感兴趣的根际菌(枯草芽孢杆菌作为植物有益菌,大肠杆菌作为有害菌)注射进芯片通道内,这些方法在根-菌互作的芯片研究中被普遍使用。为了实时显微观察,该装置直接安装在显微镜上。在无菌芯片中接种了表达红色荧光蛋白的枯草芽孢杆菌和表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌,使用激光扫描共焦显微镜分别荧光成像并叠加图像,发现在接种后12 h 当中,枯草芽孢杆菌向根伸长区聚集并定殖,大肠杆菌却被排除在根表面之外,通过图像观察菌群行为动态,可推测出有益菌对植物针对病原体的保护机制。除使用荧光标记的细菌之外,该研究还使用了仅在6 个特定根区(皮层、脉管系统、根毛等)表达绿色荧光蛋白的6 种荧光拟南芥株系,并与红色荧光蛋白的枯草芽孢杆菌图像叠加,观察到了杆菌接种后6 h 内向根伸长区的明显趋化行为,实现荧光标记的植物和细菌共同成像。

图1 针对根-菌互作的芯片Fig.1 Chip for root bacteria interaction

在可见光(包括荧光)手段之外,电子显微镜和原子力显微镜等先进成像技术的分辨率更高,可在根-菌互作研究中作为更高级的、细胞器水平的成像手段。比如根毛就是一种微米级的根部结构,可以应用这两种高级成像手段。与光学显微镜不同,这两者都要求观察面暴露在外,而根却被封装在芯片中。由于等离子体氧化法的封装是不可逆的,很难打开封装以将根和根际区暴露在外。针对这一需求,Aufrecht 等[12]设计了一种可拆卸的、针对根毛研究的芯片,PDMS 并未化学键合到玻璃片上,而只是在高压灭菌时形成了较弱的物理键,且用琼脂固化围住PDMS 以进一步固定及保湿,如图1(b)所示。其可在光学成像完成后拆卸开以供电镜等成像。针对根毛研究的目的,芯片被设计成了两层(Two-layer)式的阶梯状腔室,较高的腔室(200 μm)容纳主根、两侧较低的腔室(20 μm)容纳根毛,实测证明根毛生长时可自然粘附在PDMS 面上,在拆卸过程中可保持在原位,利于后续的电子显微镜/原子力显微镜对根毛的成像研究。研究人员进一步使用该芯片跟踪了2种植物益生菌在拟南芥发育早期根部定殖情况[13],结果发现,无论细菌种类和接种浓度如何,4 天后细菌细胞在根表面的覆盖面积均为1%～2%,且根的发育情况很大程度上取决于细菌接种的种类和浓度。

3 芯片技术对不透明栽培基质的成像优势

芯片通道中装载液体基质时,其在光学上透明的性质有助于成像,但液体并不是自然界或人工栽培的主流基质,自然环境中的根-菌互作大多发生在土壤等固体基质中。若将土壤引入芯片,以解决土壤颗粒不透明导致的可见光成像困难等问题,生物荧光和某些显微光谱成像技术或可成为其研究手段。

Mafla-Endara 等[14]设计了土壤芯片,将土壤置于芯片通道入口处,以可见光观察土壤及微生物扩散进入通道的过程,以揭示土壤生态系统的形成过程。研究发现,土壤液体和真菌菌丝是土壤物质扩散的主要驱动力,土壤颗粒和微生物在充满液体的通道中扩散比在空气中快得多,且真菌菌丝可携带细菌穿过气体障碍而扩散定殖。芯片成像还可用于量化土壤颗粒的运动模式,对所得显微视频中2～6 μm 土壤颗粒使用自动追踪算法制作速度-位置热图,发现土壤颗粒被芯片内部的流水拖拽形成蜿蜒的运动模式,也使细菌很快地移动。虽未引入植物,该研究使用的土壤芯片已展现了对根-菌互作的可见光成像研究潜力。

也有研究尝试让植物根进入装载有固体基质的芯片,以研究基质中的根-菌互作。Gao 等[15]描述了EcoFAB(Ecosystem Fabrication)芯片制作方法,可向通道内装载沙子或土壤作为基质,以期在更接近自然条件的微环境中研究根-菌互作,如图2 所示。观察发现,虽然在亮场(可见光)下,沙子和土壤的不透明性质让埋在其中的根系和微生物不可见,但在荧光显微镜下,荧光标记的根际益生菌Pseudomonassimea在土中清晰可见,展现了荧光技术克服土壤不透明性成像的潜力。这种益生菌在沙子中集中于植物根尖,而在土壤中集中于芯片开口处。研究表明沙子的贫营养迫使益生菌定殖于根尖以摄取分泌物,而土壤的富营养使芯片开口处的氧气成为益生菌的首要需求。

图2 EcoFAbs 的应用[15]Fig.2 The applications of EcoFABs[15]

值得注意的是,EcoFAB 的实验流程认为可使用镊子将裸露的植物幼苗直接从发苗的固体培养基上移栽至芯片的孔道内[15];而几乎所有其他芯片-植物的结合研究都选择使用内有固体培养基的移液器吸头作为发苗载体,并模块化地整体移栽至芯片孔道内[10,13,16],以防止移栽过程对根的伤害。使用移液器的成活率明显高于使用镊子的移栽,虽然使用镊子的做法更接近自然条件,但对实验操作要求较高,很难不伤害根系。至于直接在灌注培养基的芯片中发苗的方法[17],由于植物的发芽率并非100%等原因,失败率相对更高。

针对土壤颗粒对可见光的不透明性,Pucetaite 等[18]推荐对土壤芯片使用可见光光谱之外的、先进的显微光谱成像技术,以克服土壤的不透明性,利于在微观尺度监测土壤微生物和相关的生物地球化学过程。这些非可见光的显微光谱成像技术包括红外吸收、拉曼散射和基于同步辐射的X 射线显微光谱技术等,有时需要在土壤中加入稳定同位素或纳米贵金属粒子等辅助成像定位,在微生物鉴定、代谢物/污染物的定量/定位等方面各有优势,也可运用于基于固体基质芯片的根-菌互作研究中。

4 芯片技术对根际化学环境的操控/采样功能优势

利用微流控亦可在时空上快速操控/监测根周围的化学环境,研究根部对生物或非生物因素的动态响应,例如一系列以RootChip 命名的芯片设计[19],如图3 所示。最初Grossmann 等[19]开发的RootChip 被用于根对化学环境的响应研究,并以根内的葡萄糖荧光传感器开展荧光成像,成功发现细胞内糖水平的改变主要发生在灌注了葡萄糖的根尖。对于使用拟南芥的研究,RootChip 可在几厘米内(＜10 cm)部署多个平行通道,以一次性开展多个植株的重复性实验。Fendrych 等[20]采用竖直放置的vRootChip(v 意为vertical,竖直以不影响根向地性)研究根部生长的基因通路,观察拟南芥根生长情况数天,发现无生长素存在时拟南芥的根生长速度会在30 s 内迅速下降;补充少量生长素后,根生长速度又会在2 min 内恢复;并通过向芯片中根际环境注入cvxIAA、ccvTIR1 等人工配体,最终确认了以TIR1/AFBAux/IAA 共受体复合物为基础的一个调节根生长的非转录分支[20]。Guichard 等[21]开发了根生长通道更长的RootChip-8S 微流控装置,Denninger等[22]用其跟踪观察了与根毛形成相关的细胞极化过程机理,发现基因GEF3 在细胞极化过程中有作为细胞膜标志物的作用。

图3 安装8 个植物的RootChip[19]Fig. 3 Image of a RootChip with eight mounted live plants[19]

一些芯片设计甚至可令同一植株的根部的不同部位分别处于不同化学环境中,以在完全排除个体差异因素的前提下,直观对比不同化学环境对根双侧的影响或对特定根段的影响。面向根生理学或环境异质性研究,研究人员通常使用双流或多流汇总的方式,即多种液体从多个入口汇总到同一条芯片通道中,来营造分界式共存的液体化学环境。

对于分根段施加不同的化学环境,Meier等[23]在2010年开发了可对拟南芥施加多层流化学刺激的芯片,实际使用生长素类似物2,4-D 和生长素抑制剂NPA,层流的方向与根垂直,以验证生长素和抑制剂对指定根段的影响。研究设置了3 个进液口以达成3 层的层流,以控制流量的手段成功制造了厚度10 μm(约1 个根细胞长度)的2,4-D 层,这一厚度是被掺杂在2,4-D 中的荧光微球所显示。因为使用了生长素调节剂偶联荧光蛋白的拟南芥株系,采用荧光显微镜观察到了2,4-D 在短短几分钟后令10 μm 长的根段长出了根毛,表明了生长素影响可在单个根细胞尺度上发生,也证明了微流控研究在很小尺度(～10 μm)上的化学刺激对根影响的能力。值得一提的是,由于层流的方向与根垂直,验证了大/小的流量中根的生长没有显著区别,从而排除了剪切力(～10 dyne/cm2)可能造成的额外影响。

对于双侧施加不同的化学环境,Stanley 等[16]设计了双流RootChip(Dual-flow-RootChip),令2种液体平行于根轴同时进入通道,形成不对称的化学环境,也描述了详细的芯片实验步骤[24]。研究分别采用NaCl、磷酸盐和聚乙二醇在双流RootChip 中模拟干旱等胁迫形式,在根双侧不对称处理,研究根毛生长情况,证明根在生理和转录水平上具有局部适应环境中异质条件的能力,也证明双流芯片方法有助于还原根与环境相互作用的决策过程[16]。研究表明,每个根毛细胞可以自主地对环境做出响应[16,23]。

微流控芯片的采样功能有较大潜力。芯片的流出液是其内部环境的重要样品,通过收集芯片的流出液,即可完成植物根际微生物和根系分泌物的采集,从而进行根际微生物组与代谢组分析。但实际开展了采样并使用组学手段分析的研究并不多。其原因是关注复杂微生物群落研究较少,而对有限个菌株的行为,使用荧光标记等技术即可揭示,如Massalha 等[10]和Aufrecht 等[13]的研究;另外对于根际研究,很多根际菌定殖在根部表面甚至内部,难以随流出液流出。

5 芯片技术对根系形态等特殊需求的优势

植物根系具有多种形状和尺寸,可为之相应设计适合的微流控通道和腔体,以让植株正常生长或方便成像。为研究根系较粗的植物,Khan等[25]使用3D 打印的模具制备了腔体高度10 mm的PDMS 材质芯片,如图4(a)所示,用于研究二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon,根系直径1～3 mm)的根细胞和分析渗透胁迫下的基因表达,发现了基因BdDi19 在幼苗短期渗透胁迫期间有表达。此外,针对须根系统研究,相对于传统的单条直道的芯片设计,Chai 等[26]采用多室设计的微流控芯片,如图4(b)所示,令水稻的分枝根生长到一组径向的花瓣形室中,用以研究渗透胁迫(模拟干旱环境)对根系发育的影响,发现随着聚乙二醇(PEG6000,用于营造渗透胁迫)浓度的增加,根的生长变慢,根毛的数量和长度增加,根尖边缘细胞的发育和聚集增多。

图4 应用于不同植物的芯片Fig.4 Chips for different plants

为了方便显微观察,微流控芯片的尺寸普遍设计得较小,并且使用拟南芥等小型草本物种,这让根-菌互作的长期化观察以及对个体较大的木本植物的研究成为挑战。Noirot-Gros 等[27]设计的根系-微生物相互作用芯片(RMI-chip),如图4(c)所示,通道长达36 mm,可以培养山杨(木本植物)幼苗的根超过1 个月,并且可以连续使用显微镜观察根-菌互作。研究发现细菌需要在山杨根部表面形成生物膜才能持久定殖。RMI 芯片加以修改或优化,可以用于长期观察生长缓慢的植物,或者短期研究生长较快的植物。

此外,设计功能导向性很强的特殊结构芯片,如Massalha 等[10]的TRIS 系统还有一个双根通道版本,在同一腔室里生长2 株拟南芥的根,并设计了分隔结构避免双根的物理接触,却允许微生物细胞和信号分子的自由流动,以直观地显示细菌对不同基因型株系根部的定殖偏好。根据具体需求而设计开发出来的微流控芯片更能满足各种植物生长的特殊需求,也是微流控芯片的优势之一。

6 根-菌互作空间研究现状及展望

高等植物是BLSS 的功能核心,但空间环境因素导致植物生长处于逆境,对植物的生长发育具有显著影响。在太空飞行等空间环境下发现在微重力下生长的植物表现出对植物病菌的敏感性增加[28],地面3D 回转模拟微重力效应下的实验也证明了在模拟微重力效应下病菌更易侵染植物[29-31]。一方面可能是因为微重力对细胞壁的重生和木质素的合成起到了抑制作用[32],从而利于病原真菌的侵染;另一方面推测是微重力影响了植物宿主与自身微生物的相互作用。虽然植物遗传适应相对较慢,但植物共生的微生物却能够很快地适应环境变化[33]。而植物根际微生物组是植物的第2 套基因组的组成部分,在植物生长发育过程当中起着至关重要的作用。植物益生菌对植物具有保护机制,可以形成生物膜以及生产植物激素从而提高植物个体抵御非外来的微生物环境胁迫的免疫能力、诱导免疫抗性等多种手段,从而来增强其对宿主的免疫抗逆、抗病能力[34],且微生物是BLSS 中必然存在的一个链环,因此有必要研究空间环境下植物的根-菌互作。

但是受控条件下植物根际微生物的结构变化以及潜在威胁微生物研究甚少。由于空间实验的空间有限,即使对于探空火箭等所拥有的超过10 cm × 10 cm × 10 cm 体积的实验空间[35-36],对于使用传统栽培方式的根-菌互作研究也明显不够。而且,由于空间搭载机会的稀缺和昂贵,很多实验必须先期在地面开展,在回转仪等模拟的微重力环境下进行[37-38]。与真正的空间实验相似,回转仪可供实验的区域非常狭小,同样难以容纳传统栽培方式的植株。

微流控技术可以成为空间生物学研究中很有前途的工具,已经运用在国际空间站或卫星搭载的太空实验上。如应用于国际空间站的一种新的不依赖培养物的微生物监测系统(the Lab-On-a-Chip Application Development Portable Test System,LOCAD-PTS)[39],在15 min 内定量分析了舱室表面的内毒素(革兰氏阴性细菌和真菌的标志)。在目前第一个长时间的活体生物立方体卫星实验中,Nicholson 等[40]开展生命有机体轨道空间环境生存性(Space Environment Survivability of Living Organisms,SESLO)实验6 个月,测定了枯草芽孢杆菌孢子在空间环境中长期静止(14、91和181 天)后的萌发、生长和代谢情况。但目前空间生物学研究中,未将微流控技术应用在植物根-菌互作研究上。而微流控芯片体积小,且目前已有一些微流控根-菌互作研究没有采用注射泵,同样可实现根际营养液的更新[15]。微流控芯片作为载体更能满足研究需求。因此,如图5 所示,对于长期进化适应1 G 重力的地球环境的植物而言,空间微重力环境属于典型的逆境环境,可能导致植物菌群失调,但目前对其机理并不清楚。基于微流控技术能更直观地研究植物-微生物在空间极端环境下相互作用机理,并可以通过其机理精准调控植物根部菌群,使植物拥有更大的固碳能力和更强的抗逆特性。

图5 空间环境下微流控技术在根-菌互作研究中的运用Fig.5 Application of microfluidic technique in the study of root-bacteria interaction in spatial environment

微流控技术在根-菌互作研究中的显著优势能进一步帮助研究者理解植物学和微生物学研究的热点问题。但在空间环境下基于微流控技术开展植物根-菌互作研究依然存在着许多问题:①空间环境下,植物根生长会改变方向,对基于微流控技术的根菌互作观察有一定影响;②在芯片设计的过程中还需要考虑表面张力会成为界面的主要力;③目前的微流控技术主要针对在透明基底上成像,这将偏离自然土壤系统中根际的群落结构。这些问题需要利用更有效的方法来解决。

7 结语

目前,已有研究将微流控技术运用于根-菌互作中,显著提高了实验效率与根菌研究结果的分辨率。然而迄今为止,国际上在空间环境下应用微流控技术研究植物-微生物相互作用仍是空白。微流控技术具有便于对根菌互作实时成像以及对根际化学环境的操控/采样等优势,能够精细刻画反映出空间环境下植物-微生物互作规律,有益于揭示植物-微生物稳态对空间环境效应的响应与适应机制,从而助力空间环境下植物健康稳定生产,为BLSS 空间实际构建应用奠定基础。