非小细胞肺癌中circ-SOX4 调控起始细胞干性并通过Wnt 通路促进肿瘤进展的机制探讨

蒋骞 张雅坤 侯维 赵妍丽 贾婷婷

非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌的80%,是肺癌病理诊断中最普遍的组织学类型。这个病理类型可进一步分为两个主要亚型,即：腺癌(LUAD)和鳞状细胞癌(LUSC)［1］。手术、放化疗是NSCLC 主要治疗手段,虽然相关分子靶向和免疫治疗取得了进展,但晚期NSCLC 患者的预后仍然很差［2］。因此,研究NSCLC演进的潜在分子机制,为治疗寻找更多有效靶点具有重要的临床意义。

肿瘤干细胞也称为肿瘤起始细胞(TICs),一直被认为是肿瘤难以消除的主要原因［3］。目前的治疗只针对大多数肿瘤细胞,而不能根除TICs,所以残留的TICs可导致治疗后肿瘤复发［4］。包括利用细胞表面标记物CD133 在内的几种方法已经被用来识别肺癌中的TICs［5］。在过去的几年中,乙醛脱氢酶1(ALDH1)+癌细胞由于其在自我更新、增殖和体内肿瘤形成方面的潜在能力而被定性为TICs［6］。研究TICs 的分子调控异常有助于进一步了解肺肿瘤生物学。更重要的是,研究TICs 相关的分子机制可能为寻找NSCLC 的治疗靶点提供依据。

环状RNA(circRNA)为具有闭环的非编码RNA 的一种亚型,与传统的线性RNA 明显不同［7］。在人类肿瘤发生发展中,circRNA 的多种调控作用(包括作为分子海绵吸附miRNA 或蛋白、编码多肽等)已引起人们广泛关注［8］。相关研究例如：环状RNA hsa_cic_0052112 通过吸附miR-125a-5p 促进乳腺癌细胞转移［9］,环状RNA hsa_circ_0001313 与结肠癌细胞的放射敏感性有关［10］,环状RNA hsa_circ_0000144 通过靶向miR-217/RUNX2 轴调节膀胱癌的进展［11］。此外,越来越多的证据也证实了circRNA 在NSCLC 进展中的关键作用。例如：环状RNA hsa_circ_0078767 通过吸附miR-330-3p 调节RASSF1A 的表达,从而影响NSCLC 的进 展［12］。环 状RNA hsa_circ_0004015 通过靶 向miR-1183/PDPK1通路调节NSCLC的进展［13］。环状RNA hsa_circ_0008305 通过调节转录中介因子1γ(TIF1γ)抑制了转化生长因子-β(TGF-β)诱导的NSCLC上皮-间质转化和转移［14］。而hsa_circ_0131457(circ-SOX4)为一种新的环状RNA,其对肿瘤的调控作用尚不清楚。本研究为首次探讨circ-SOX4 表达与肺TICs 干性的关系以及其促进NSCLC 进展的机制,这将为NSCLC 防治提供新的探索思路。

1 材料与方法

1.1 试剂 NSCLC 细胞(A549,H1299,H1792,H226,H522,H1944,Calu-1 和H460)购自美国模式培养物集存 库(ATCC) (Manassas,VA,USA)；CCK-8 及Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；抗体anti-Oct4、anti-Nanog、anti-SoX2、anti-Sox4、anti-GAPDH 均购自Abcam (Cambridge,USA)；抑制 剂RO4929097、LY294002、CHS828 和KYA1797 k购自Sigma-Aldrich (St.Louis,MO,USA)；表面标记物CD133 购自 Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach,Germany)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 将细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养基,在37 ℃、5% CO2条件下进行培养。sh-circ-SOX4#1/2及其阴性对照shNCs 由Genechem(Shanghai,China)构建。circ-SOX4 过表达质粒和空pcDNA3.1 载体由ZonHon Biopharma Institute(Changzhou,Jiangsu,China) 构建。6 孔板细胞培养1 d,用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)转染,48h后收获细胞。

1.2.2 定量聚合酶链反应 使用TRizol Reagent(Takara,Tokyo,Japan) 提取细胞总RNA,合成cDNA。采用SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems,Waltham,MA,USA) 在Bio-Rad (Bio-Rad,Hercules,CA,USA) 上进行qRT-PCR。相对表达归一化至GAPDH,采用2-ΔΔCt方法测定表达量比值。

1.2.3 CCK-8 和平板克隆形成实验 转染后的细胞按1×105/孔的数量接种于96 孔板中并培养,用CCK-8 试剂盒检测细胞在不同时间点(0、24、48、72、96 h)的增殖情况,通过分光光度板阅读器(Olympus,Tokyo,Japan)监测450 nm 的吸光度。克隆形成实验中,将细胞按7×102/孔的数量接种于6 孔板中。培养14 d 后,固定细胞并染色,人工计数形成的克隆细胞 (≥50 个细胞)。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 将转染细胞接种于6 孔板中并培养,然后用冷磷酸盐缓冲液冲洗2 次,再重悬细胞。随后使用冰乙醇固定上述细胞1 h。最后使用Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒染色,并通过流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)检测细胞凋亡。

1.2.5 Western blotting 用RIPA 缓冲液(Invitrogen)裂解细胞并提取总蛋白质,经SDS-PAGE 电泳分离蛋白,然后转移到PVDF (Bio-Rad)。在室温下,用5%脱脂奶粉封闭2 h 后,TBST 缓冲液洗膜3 次,再与相应一抗孵育过夜。次日将膜与羊抗兔抗体(1∶4000)或羊抗鼠二抗(1∶8000)在室温下孵育1 h,随后加入化学发光底物(Bio-Rad),最后使用ImageQuant LAS4000 成像分析仪(GE,USA)检测。由Image J 软件分析蛋白质的相对表达量。

1.3 统计学方法 所有实验均独立进行3 次。数据以均数±标准差()表示,并通过GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)和SPSS 19.0(SPSS,Chicago,IL,USA)软件进行分析。差异分析采用ANOV A 或Student's t-test。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 circ-SOX4 在肺TICs 中表达显著上调并与TICs干性相关 查询在线数据库(http://cgga.org.cn:9091/circRNADisease/),获得NSCLC 原发肿瘤的circRNA 表达信息,并按ALDH1+和ALDH1-进行分类比较。结果显示：在ALDH1+肿瘤细胞中,hsa_circ_0000497、hsa_circ_0018082、hsa_circ_0024105、hsa_circ_0044360 及hsa_circ_0131457 表达显著上调。见图1A。

采用流式细胞术将肺癌细胞(A549、H1299、H1792、H226、H522、H1944、Calu-1 及H460) 按CD133+及CD133-进行筛选分类。qRT-PCR 检测结果显示：相较于CD133-肺癌细胞,hsa_circ_0131457(circ-SOX4)在CD133+细胞中的表达显著上调,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。见图1B。

与阴性对照相比,过表达circ-SOX4 使CD133-H-1944/Calu-1 细胞中CD133 表达显著上调,而敲减circ-SOX 则显著下调CD133+细胞中CD133 表达,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。见图1C。

图1 circ-SOX4 在NSCLC 中的表达及与TICS 干性关系

2.2 下调circ-SOX4 抑制肺TICs 的增殖、促进其凋亡 与阴性对照相比,敲减circ-SOX4 能显著抑制体外培养48、72、96 h 时CD133+H-1944/Calu-1 细胞的增殖,减少CD133+H-1944/Calu-1 细胞的克隆形成,增加CD133+H-1944/Calu-1 细胞的凋亡,下调干性基因OCT4、Nanog、SOX2 和SOX4 的表达,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。见图2A,2B,2C,2D。

图2 下调circ-SOX4 对肺TICs 增殖、凋亡及干性的影响

2.3 circ-SOX4 通过Wnt 通路促进肺癌进展 与阴性对照相比,过表达circ-SOX4 能显著促进体外培养48、72、96 h 时CD133-Calu-1 细胞的增殖,增加CD133-Calu-1 细胞克隆形成,抑制CD133-Calu-1 细胞凋亡,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。Wnt 通路抑制剂KYA1797 k 可逆转过表达circ-SOX4 对上述细胞的影响。相较于单纯过表达circ-SOX4,过表达circ-SOX4联合KYA1797 k 能显著抑制体外培养48、72 和96 h时CD133-Calu-1 细胞的增殖,减少CD133-Calu-1细胞克隆形成,并增加CD133-Calu-1 细胞凋亡,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。而RO4929097(Notch通路抑制剂)、LY294002(PI3K/AKT 通路抑制剂)和CHS828(NF-κB 通路抑制剂)对上述转染细胞的增殖和凋亡无显著影响,差异均无统计学意义(P＞0.05)。见图3A,3B,3C。

图3 上调circ-SOX4 后,Wnt 等通路抑制剂对肺TICs 增殖及凋亡的影响

3 讨论

目前,NSCLC 的主要治疗方法包括手术、放化疗、靶向及免疫治疗。由于上述治疗并非特异针对TICs,其残留成为肿瘤复发的重要因素［4］。多项研究阐明了环状RNA 在乳腺癌、结肠癌和膀胱癌中的关键调控作用［9-11］。因此,需要以肺癌TICs 为研究NSCLC 进展的切入点,鉴定在肺癌TICs 中差异表达的circRNAs,并进一步研究其生物作用。本研究筛选出在NSCLC 起始细胞中表达上调的circ-SOX4,验证其与TICs 干性正相关。并通过功能实验证实circ-SOX4 能促进TICs 细胞增殖,正向调控其干性,抑制其凋亡。上述研究说明,circ-SOX4 是NSCLC 进展中的重要癌基因。

越来越多的证据表明,Wnt 通路在多种肿瘤中发挥重要作用。例如,Wnt 途径的蛋白质可用作胶质母细胞瘤中调节CD133+癌症干细胞的靶标［15］。RHBDD1通过Wnt 途径和对ZEB1 的调节促进结直肠癌的细胞转移［16］。在本研究中,探讨了Wnt 通路在circ-SOX4促进NSCLC 进展中的作用。功能实验证实circ-SOX4通过Wnt 通路促进肺癌增殖,并抑制肺癌凋亡。由此说明Wnt 通路在NSCLC 进展中发挥了正向调节作用,但Wnt 通路是如何激活,以及通路相关的上下游调控机制尚待进一步研究明确。

综上所述,在NSCLC 起始细胞中表达上调的circ-SOX4 能正向调控TICs 干性,并通过Wnt 通路促NSCLC 增殖,抑制其凋亡。因此,对circ-SOX4 及Wnt通路调控TICs 机制的研究将为NSCLC 防治提供新的思路。