PNEC-ILC2神经免疫通路在支气管哮喘中的研究进展

黄帅阳 崔红生 候丹 吕明圣 黄贵锐

1北京中医药大学第三附属医院（北京100029）；2北京中医药大学（北京100029）

支气管哮喘（简称哮喘）是由下呼吸道慢性炎症和气道高反应引起的一种常见肺系疾病，临床上哮喘患者常反复发作，全世界人口大约有三分之一的哮喘患者，每年有近250 万患者死于严重恶化，带来了严重的健康和社会经济负担［1］，充分认识哮喘的病理生理学和哮喘发生的病理机制是非常必要的。呼吸道经常暴露在抗原和各种病原体中，呼吸道中的免疫细胞是抵抗这些病原体的第一道防御系统，既往认为免疫炎症机制贯穿于哮喘疾病发生发展的全过程，包括固有免疫和适应性免疫，涉及的免疫细胞包括［2］：T 辅助2 型细胞（helper type 2 cells，Th2s）、2 型固有淋巴细胞（type 2 innate lymphoid cells，ILC2）、分泌IgE 的B细胞和嗜酸性粒细胞。ILC2s 上游的激活通路尚未完全清楚，研究发现肺神经内分泌细胞（pulmonary neuroendocrine cells，PNECs）可以与ILC2 形成神经免疫模块，PNECs 作为一种罕见气道上皮细胞，具有神经内分泌功能，目前作为肺内传感器而备受关注，过敏原等有害刺激物可以通过激活呼吸道的感觉传入神经亚群，触发防御性反应，如呼吸暂停、咳嗽和支气管痉挛［3］。PNEC-ILC2 神经免疫通路激发产生肺部Th2 免疫炎症，共同参与急慢性哮喘过程的调控，调节肺内“神经-内分泌-免疫（neuroendocine-immune，NEI）”网络可能成为未来哮喘防治的另一研究热点。本文结合近年相关文献，对PNEC-ILC2 神经免疫通路在哮喘中的调控机制作一综述。

1 PNEC 与哮喘

1.1 PENC 受神经支配PNEC 于1954年首次被发现，它是肺内一种罕见的、由神经支配的气道上皮细胞类型，PNEC 可簇聚形成菱形或卵圆形小体，即高特异性的神经上皮小体（neuroepithelial bodies，NEBs），常存在于支气管分支点连接处富集，是一种具有神经内分泌功能的特殊上皮细胞［4］。形态学观察发现，NEBs 与味蕾、颈动脉体的化学受体在结构上有相似之处，PNEC 这种特殊分布和形态结构特征可能是感知呼吸道缺氧条件和过敏原的最佳方式［5］。

目前研究报道NEBs 具有双重感觉神经纤维支配：一是迷走神经结状神经节的钙结合蛋白D28K 和P2X3 受体免疫神经纤维；另一是背根神经节的P 物质（substance P，SP）和降钙素基因相关肽（calcitoningene-related peptide，CGRP）免疫反应性神经纤维［6-7］。研究人员切断大鼠左侧迷走神经发现NEBs 神经末梢退化或消失，神经节后副交感神经应激性增高，PNEC 数量、大支气管内血清素（serotonin，5-HT）和CGRP 的免疫染色阳性细胞也明显增加，表明迷走神经具有支配、调节PNEC分化及分泌神经活性物质的功能［8］。

1.2 PENC 的神经内分泌功能PNEC 在电镜下可观察到胞浆内有大量特征性的致密核心小泡（dense core vesicles，DCVs），直径从60 ～200 nm 不等，形态各异；NEBs 受感觉神经纤维相支配的同时，携带对缺氧、高碳酸血症和尼古丁等多种刺激敏感的膜受体，这些膜受体受到内、外界环境变化时会刺激DCVs 合成、储存和释放许多生物活性物质，比如5-HT、铃蟾肽/蛙皮素（bombesin）、CGRP、血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）、降血钙素、脑啡肽、生长抑素、胆囊收缩素和SP［9］。研究证明在人体休息时，每分钟大约有5 ～8 升空气进出肺部，空气中O2和CO2的浓度不同，可能携带过敏原，这些信号可以被PNEC 感知、传递，并被加工成生理输出，比如PNEC 可以感受外界低氧环境刺激，引起一系列的神经冲动来调节呼吸节律和肺的生理功能［10］。PNEC 在调节胎儿和新生儿肺的发育也发挥了关键作用，经过实验证明，Bombesin/胃泌素释放多肽（gastrin-releasing polypeptide，GRP）可以促进子宫内胎肺的气道上皮分化和肺的成熟［11］。此外，PNEC 还具有干细胞特性，研究发现PNEC 可以平衡和修复严重的气道损伤，发生再生反应［12］。

1.3 PNEC在哮喘发生机制中可能的作用靶点病理状态下，NEBs 的形态和功能与几种疑难的人类肺部疾病息息相关。在很多肺部疾病的病理形态下均可观察到PNEC 数量增加，PNEC 的增生可引起化学高反应性和神经多肽分泌过度，从而导致多种肺系疾病，包括哮喘、支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）、囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、先天性肺疾病、肺动脉高压、婴儿猝死症、肺神经内分泌肿瘤等等［13］。Gu X 团队研究发现［14］原代培养的人气道上皮细胞暴露于挥发性化学物质可降低PNEC 中5-HT 水平，并导致CGRP 释放到基础培养基中。VIP 作为细胞因子/趋化因子可发挥广泛的免疫功能［15］，VIP 可以与嗜酸性粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等免疫细胞的特异性受体结合，在过敏性疾病的发生过程中发挥重要作用。PNEC 还可以分泌γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）促进杯状细胞的分化而产生过多黏液，研究人员利用黏液预诱导正常人支气管上皮细胞，发现药物阻断GABAα 和GABAβ 受体信号逆转了IL-13 对肺组织黏蛋白5ac（MUC5ac）基因表达和杯状细胞增殖的影响［16］。因此，PNEC 上的化学受体及其下游信号可能成为未来治疗肺系疾病以及气道超敏相关的作用靶点。

2 ILC2 与哮喘

2.1 ILCs 细胞特性与激活途径ILCs 在调节组织稳态和炎症发病机制中具有重要的调节作用，ILCs 分为 三 个 主 要 的 亚 型：ILC1s（type 1 ILCs，ILC1s）、ILC2s 和ILC3s（type 3 ILCs，ILC3s），ILCs 被认为是T 淋巴细胞的天然配对物，ILC1s、ILC2s 和ILC3s 分别与CD4+T 辅助1 型细胞（T helper type 1，Th1）、T 辅助2 型细胞（T helper type 2，Th2）和Th17细胞配对［17］。其中ILC2s 在过敏性鼻炎、慢性鼻窦炎伴鼻息肉和哮喘等Th2 型炎症疾病中表达很高，ILC2s 通过激活嗜酸性粒细胞、B 细胞、肥大细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞介导产生2 型细胞因子，包括IL-5 和IL-13，促进平滑肌收缩、嗜酸性粒细胞浸润和杯状细胞增生，从而启动和放大气道炎症反应［18］。

ILC2s 通常通过以下的主要信号激活并产生2型细胞因子［19］：（1）白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）介导的家族细胞因子（IL-1b、IL-18、IL-33）、IL-25 和肿瘤坏死因子超家族，可以通过丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）激活核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）信号传导和转录激活因子-1（AP-1）通路，刺激IL-5 和IL-13 的产生。（2）ILC2s 还表达IL-2 和IL-7 家族细胞因子受体，IL-2、IL-7、IL-9 和胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）可激活STAT5（signal transducer and activator of transcription 5）通路，成为ILC2s 介导的Th2 型炎症的共刺激和增强因子［20］。（3）白三烯（leukotrienes，LTs）和前列腺素（prostaglandins，PGs）在内的脂质介质在体内平衡和炎症中发挥重要作用，脂质介质（LTC4、LTD4、PGD2）可通过活化T 细胞核因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）途径诱导ILC2 迁移和产生Th2 型细胞因子，包括IL-4、IL-5和IL-13［21］。（4）神经肽包括神经髓质U（neuromedin U，NMU）、VIP 和CGRP 也被发现可直接或间接刺激ILC2s，产生Th2 型炎症反应［22］。

2.2 ILC2s 在哮喘中介导的气道炎症ILC2s 介导的炎症主要通过IL-4、IL-5、IL-9 和IL-13 等2 型细胞因子的产生，其中IL-4 和IL-13 是控制B 细胞IgE 反应、上皮细胞重塑和黏液产生、诱导嗜酸性粒细胞趋化和M2 巨噬细胞极化的关键因子［23］。IL-9 可以促进肥大细胞生长和杯状细胞分化［24］。许多临床研究都揭示了ILC2s 在气道2 型炎症性疾病中的重要性。变应性鼻炎患者经变应原刺激后发现外周血和刮除鼻腔标本中的ILC2s 均增加，且这些刮除鼻腔标本中的ILC2 数量与嗜酸性粒细胞数量和IL-5 浓度呈正相关［25］。SMITH 等［26］研究人员还发现，哮喘患者痰中IL-5、IL-13、ILC2s 的数量表达均升高。

3 PNEC-ILC2 神经免疫通路

3.1 PNEC-ILC2神经免疫通路在哮喘中的作用PNEC 的效应主要通过分泌神经肽、神经递质等实现。体内实验证明PNEC 作为精确的气道传感器，通过神经肽引发免疫反应，SUI 等［27］研究员在Science 发文表示，PNECs 位于靠近气道分支点的ILC2s 附近，在无PNECs 表达的A-scl1（PNEC 形成过程中的关键转录因子）基因突变合并过敏性哮喘的模型小鼠中存在严重的Th2 型炎症反应迟钝。PNECs 一方面可能通过CGRP 刺激ILC2s，诱导初始CD4+T 细胞向Th2 细胞分化，刺激释放IL-5，IL-5反过来可以招募嗜酸性粒细胞，引发一系列炎症级联免疫反应；另一方面可释放GABA 诱导杯状细胞的增生［27-28］。这些研究发现均表明PNECILC2 在气道分支点起作用，可以增强过敏性哮喘反应，PNECs 可直接向ILC2s 发出信号刺激，共同形成神经免疫通路，感知并响应进入气道的环境刺激。

近年来，随着生物-心理-社会医学模式的发展，精神、心理等因素对哮喘的发作和加重的影响受到医学科研人员的广泛讨论，有学者提出了“心理应激哮喘”的概念［29］。有研究发现应激状态下其可通过释放乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）等神经递质激活肺部下游的PNEC，刺激PNEC-ILC2 神经免疫通路，继而产生Th2 免疫炎症发生或加重，这说明心理应激诱发哮喘的病理机制与副交感神经系统异常激活密切相关［30］。

3.2 中医药对PNEC-ILC2 通路的研究进展糖皮质激素是目前控制哮喘发作最有效的药物，但其长期应用存在着下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic pituitary adrenal，HPA）轴功能抑制、激素依赖或抵抗等副作用。中医药治疗哮喘疗效独特，毒副作用小，具有广泛的群众基础［31］。PNEC 分泌的肺内神经肽在哮喘发病机制的重要作用，让许多研究学者将研究方向转移到了中医药对哮喘肺内神经肽的作用。在基础实验中发现黄龙止咳口服液可能通过降低介质白三烯E4（LTE4）、神经生长因子（NGF）、CGRP 含量来调节免疫学炎症介质［32］；麻杏石甘汤干预哮喘大鼠模型后发现，大鼠肺组织内CGRP、SP 含量和气管中TRPV1 蛋白表达明显降低［33］。此外研究还发现白芥子散能增强VIP 并减弱SP、CGRP 在肺组织中的表达，从而有效改善大鼠过敏性哮喘反应［34］。这些中医药的实验研究进一步证实了PNEC-ILC2 通路在哮喘的Th2 免疫炎症的调节中发挥着关键作用。

课题组既往网络药理学研究［35］得到中药复方哮喘宁颗粒和心理应激哮喘的交集靶点，通过GO和KEGG 富集分析得知这些靶点之间的基因互作模块，发现哮喘宁颗粒可能通过神经活性配体受体相互作用来调节肺内NEI 网络。近年来中医大家多从肝肺相关理论，提出了治疗中医“哮病”的新思路，肝失疏泄的病理变化与大脑皮层功能及自主神经功能关系密切，情志变化可引起NEI 网络失调［36］。从病机上分析，肝肺两脏生理相关、病理相因，若情志不遂，肝气亢害，则肝气反侮肺金，肺失肃降，气逆于上而发咳喘。这与外界环境刺激PNEC-ILC2 神经免疫通路异常激活介导肺部Th2 免疫炎症的病理过程不谋而合。因此PNECILC2 神经免疫通路可能在哮喘发生发展和诱发加重的过程中发挥了重要作用，但仍需更多的实验证据加以验证。本课题组基础实验发现哮喘宁颗粒具有调节心理应激性哮喘大鼠心理应激状态作用，并缓解气道炎症反应［37］。研究人员用中药复方平喘方干预哮喘小鼠模型，发现可有效降低杯状细胞和PNEC 增殖、肺组织内炎症和气道粘液分泌过多，且平喘方可能通过PNEC-GABA-IL13-Muc5ac 轴来减少气道炎症和粘液高分泌来控制哮喘发作［38］。

4 展望

越来越多的证据表明，PNEC-ILC2 模块作为神经内分泌-免疫网络的重要信号通路，在哮喘等变应性疾病的发生发展过程中发挥了重要作用。PNEC 和ILC2s 在哮喘中明显增多，其中ILC2s 的激活和抑制机制在过去的十年中已经越来越清晰，但PNCE 的神经免疫功能对ILC2s 的激活机制尚未完全清楚。研究者在通过调控PNEC 的神经支配、抑制PNEC 所分泌的神经肽、阻断ILC2 激活通路来治疗哮喘取得了一定的成果，但其在临床上的运用价值还有待进一步验证。目前除了糖皮质激素治疗外，几乎没有针对ILC2 的治疗方法，未来在这一领域的研究可能给Th2 型气道疾病（尤其是哮喘）新疗法带来新的视角，例如抑制PNEC 所分泌的神经肽、阻断ILC2 上游激活物、激活ILC2抑制通路或抑制ILC2 介导的通路，但仍待进一步的研究。此外，中医药具有广阔的应用前景，“肝肺相关理论”在调节人体心理因素对哮喘的影响方面具有显著优势，在调节肺内NEI 网络具有重要价值。研究中医药在PNEC-ILC2 神经免疫通路的作用机制，可为开发哮喘的中药防治提供检测指标和理论依据，具有重要的临床价值。