奶牛亚急性瘤胃酸中毒（SARA）的易感因素及其对瘤胃功能的影响

杨 坤，胡红莲，李大彪，李兰柱，张剑霞，钱 娜，于良义，白梦婷，郭 琳，高 民

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区农牧业科学院动物营养与饲料研究所，内蒙古 呼和浩特 010031；3.东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150030）

在规模化奶牛养殖场中， 为提高奶牛产奶效率， 存在饲喂过量非结构性碳水化合物和可发酵能量饲料的现象，造成大量挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）在瘤胃积累，使瘤胃液pH 值降低，瘤胃菌群失调，引发奶牛亚急性瘤胃酸中毒（subacute ruminal acidosis，SARA）［1］。 奶 牛 长 期 处 于SARA 状态会引起采食量、饲料转化率、产奶量下降，并且导致乳脂率降低。 SARA 也可引起胃肠道损伤、瘤胃炎及机体炎症级联反应，如蹄叶炎、肝脓肿、乳腺炎等［2］，给奶牛养殖业带来巨大的经济损失。 据统计， 美国每年因奶牛SARA 造成约5亿～10 亿美元的经济损失［3］。 奶牛SARA 发病率高，不易诊断，临床表现具有延迟性，在群体养殖中不易被发现［4］，给饲养管理造成一定难度。 除了饲喂过多能量饲料导致瘤胃酸度过高以外， 影响奶牛对SARA 易感的因素还有很多， 这些因素使奶牛瘤胃内环境紊乱， 瘤胃液pH 值低于正常值，从而诱发SARA。 瘤胃是奶牛发酵以及利用饲料营养最大的器官， 而瘤胃上皮细胞为微生物增殖提供温床， 是瘤胃微生物附着代谢和奶牛吸收营养的主要部位， 瘤胃上皮细胞和瘤胃微生物的协同作用为机体生长发育提供能源。 SARA 对奶牛瘤胃上皮细胞结构的完整性和瘤胃菌群造成严重影响。 通过参考国内外文献，结合前人研究进展，从不同生理阶段， 择食行为和耐受性方面分析奶牛SARA 易感因素及SARA 对瘤胃上皮细胞结构功能的影响， 以期为分析奶牛SARA 易感因素，以及SARA 对瘤胃造成功能性损伤研究提供参考。

1 奶牛对SARA 的易感差异及影响因素

奶牛SARA 的易感因素有很多， 但目前国内相关报道相对较少。 研究发现，SARA 高发病率奶牛通常处于泌乳早期、初产、采食过量可发酵能量饲料与低纤维牧草等情况， 其中饲喂过量高能饲料是主要因素［5］。 养殖场通过添加部分饲料添加剂和微生物制剂， 如碳酸氢钠或酵母培养物降低SARA 的发病率，尽管如此，多数规模化养殖场的奶牛在泌乳早期和中期的SARA 发病率依然在19%～26%［6］， 说明奶牛对SARA 的敏感性还受其他因素影响。即使在同一养殖模式下，饲喂相同高精料饲料，奶牛瘤胃液pH 值下降程度亦有很大差异，说明奶牛个体对SARA 的耐受性不尽相同。此外，择食行为、TMR 混合不均、饲养管理因素等也会导致奶牛SARA 的发生［3］。

1.1 奶牛不同生理阶段对SARA 易感性的影响

荷斯坦奶牛泌乳期根据泌乳及营养代谢等因素可划分为围产期、泌乳前期、泌乳中期、泌乳后期、干奶期5 个生理阶段。 通过总结各阶段SARA发病率的高低可判断不同生理阶段奶牛对SARA易感性差异。研究发现美国大约有19%的泌乳早期奶牛和26%的泌乳中期奶牛受到SARA 困扰［3］。Kleen［7］研究发现， 泌乳早期和泌乳中期奶牛中SARA 的发病率分别为11%和18%。 荷兰地区的围产期和泌乳前期奶牛SARA 总发病率为13.8%，而泌乳中期奶牛SARA 发病率为26%［5，8］，泌乳后期的发病情况未见报道。 由此可见， 奶牛SARA 高发病率常在泌乳前期和泌乳中期， 且泌乳中期发病率较高。 原因可能是泌乳前期与泌乳中期奶牛由干奶阶段向泌乳阶段过渡， 干物质采食量下降， 维持泌乳消耗大量能量导致能量负平衡（negative energy balance，NEB）引起氧化应激、代谢紊乱和机体免疫力下降；另一方面，从围产期到泌乳前期机体能量需求剧增， 为维持所消耗的能量， 供给精料过多， 瘤胃发酵后产酸量急剧增加，进而引起机体酸碱失衡，导致泌乳前期和泌乳中期发生SARA， 又因SARA 缺乏症状线索与临床体征延迟出现，再加上检测困难［3］，导致泌乳中期SARA 发病率高于泌乳前期。

不同生长阶段奶牛对SARA 易感性也存在明显差异。 有学者指出，初产牛瘤胃液pH 值较经产牛更易降低、瘤胃挥发性脂肪酸更易积累，更易发生代谢性酸中毒［9］，但初产与经产牛SARA 发病率的差异尚未见文献报道。大量研究表明，初产牛较经产牛更易出现能量负平衡、 乳房炎、 酮病和SARA，初产牛的高发病率可能与营养物质缺乏和外界应激有关。谢铁柱［10］通过试验发现，经产牛与初产牛产后舔舐盐砖次数、 每日躺卧持续时间有显著差异，而产后14 d 内患酮病风险和躺卧时间呈线性相关，躺卧时间每增加1 h/d，患酮病风险升高3.7%［11］， 可见初产牛较经产牛更易发生酮病，出现NEB 进而降低奶牛免疫力，使SARA 的发生率提高。 经产牛舔舐盐砖次数及持续时间显著高于初产牛［11］，舔舐盐砖可以促进唾液分泌，唾液中含有的大量碳酸氢盐和磷酸盐随着舔舐下咽过程进入瘤胃，中和发酵产生的有机酸，降低经产牛SARA 的发生率。

1.2 奶牛择食行为以及个体差异对SARA 易感性的影响

规模化养殖场中，一些奶牛的遗传背景相同、饲养管理及饲喂模式一致， 但在生产实践中检测发现不同个体对SARA 的敏感性有较大差异。 养殖过程中，因多种因素致使奶牛出现择食现象，而这一行为很可能导致奶牛对喜食的日粮成分摄入过度，当易发酵碳水化合物摄入超量时，会减少物理有效中性洗涤纤维 （physically effective neutral detergent fiber，peNDF） 摄入量， 导致瘤胃中VFA大量生成，同时咀嚼行为减少，不能及时中和瘤胃中产生的过多有机酸， 增加动物发生SARA 的风险［12］。国外有学者选取18 头奶牛饲喂精粗比为6∶4的日粮，饲喂第2 周时根据瘤胃液pH 值是否低于6.0， 将奶牛分成SARA 易感组和耐受组；36 d 饲喂期结束后，结果表明易感组进食时间较短，且在早晨进食后咀嚼时间较少， 脂蛋比较耐受组有降低的趋势， 血清中的羟基丁酸浓度和胆固醇浓度较耐受组低［13］，说明奶牛对高谷物饲喂的敏感性不同， 与咀嚼活动和血脂的变化有关， 并且发现SARA 易感奶牛存在择食行为， 择食行为和瘤胃液低pH 值存在显著负相关，易感型奶牛采食中短粒度饲料越多，瘤胃液pH 值越低［12］，易感型奶牛出现拒绝采食长粒度饲料， 此现象在耐受型奶牛中未发现［14］。 张涛等［15］将12 头奶 牛根据 瘤胃液pH 值高低分成SARA 易感组与耐受组， 结果表明，2 组荷斯坦奶牛血液和乳中脂肪酸及代谢物组成存在较大差异， 易感组奶牛氨基酸代谢与乳脂合成能力更强，对长链脂肪酸的利用效率更低，且乳品质降低。 与此同时，易感组奶牛血液中L-苯丙氨酸含量显著低于耐受组，而L-苯丙氨酸是机体免疫炎症反应的潜在标志物。综上所述，奶牛的择食行为以及对SARA 的耐受性差异是其对SARA 易感的重要原因之一。

2 SARA 对奶牛瘤胃功能的影响

瘤胃是反刍动物暂时存储食糜以及发酵的最大器官，是前胃系统中的最大组成部分，瘤胃通过瘤胃液以及附着在瘤胃壁上庞大的微生物菌群协同消化食糜产生大量有机酸， 以供机体利用，因此， 维持瘤胃内环境稳态和微生物区系平衡是保证瘤胃功能不受损伤的关键。 SARA 使奶牛瘤胃液pH 值长期低于生理范围，过酸环境使内环境稳态失衡，菌群发生改变，进一步影响瘤胃上皮细胞屏障和吸收功能以及上皮结构的完整性。

2.1 对瘤胃微生物菌群变化的影响

瘤胃中含有大量的真菌、细菌、原虫，其中细菌占比最大。它们彼此共生，负责将食糜进行分解发酵并转化为VFA、乳酸、二氧化碳、氨和甲烷等发酵产物供机体进一步吸收代谢。大量研究表明，瘤胃微生物丰度、稳定性与多样性对瘤胃液pH 值具有高度敏感性。 从门水平上看，瘤胃液pH 值下降会降低变形菌门和拟杆菌门细菌的丰度， 而厚壁菌门和放线菌门丰度升高［16］；林波等［17］通过改变泌乳水牛日粮精粗比发现，日粮精粗比越高，瘤胃中厚壁菌门与放线菌门丰度亦升高， 变形菌门和拟杆菌门丰度降低，这与李子健等［18］的研究结果一致。 从属水平上看，SARA 易感组奶牛瘤胃中不动杆菌属、普雷沃菌属、厌氧支原体属、乳杆菌属、密螺旋体属及部分未分类细菌丰度降低，双歧杆菌属、瘤胃球菌属、奇异菌属丰度升高［16］。 Kim等［19］通过饲喂高谷物饲粮使奶牛患SARA，结果导致瘤胃中普雷沃菌属相对丰度降低， 瘤胃微生物多样性显著下降， 但也有人发现SARA 持续发生时，部分真杆菌属丰度增加，使瘤胃中纤维分解被抑制，纤维分解菌如产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌丰度大幅降低， 而普雷沃菌属、 巨球型菌属、乳杆菌属丰度增加［20］。 韩郭皓等［21］研究表明，随着饲料精粗比提高，SARA 使瘤胃中产乳酸菌如罗氏菌属相对丰度急剧上升， 导致大量乳酸积累，而革兰阴性菌如拟杆菌门丰度下降、裂解死亡进而释放大量内毒素加剧瘤胃损伤，SARA 再度加剧。 总体上说，SARA 使奶牛瘤胃微生物丰度，稳定性和多样性显著降低， 但一些学者认为，SARA 并不是引起瘤胃微生物区系失衡的直接原因。 瘤胃微生物菌群失衡受SARA 与瘤胃生理生化状态改变和外界因素共同作用， 而其作用机制有待进一步研究。

2.2 对瘤胃上皮细胞相关因子表达的影响

饲喂大量高能日粮在瘤胃中发酵， 导致过度蓄积VFA 引起SARA，产生的多数VFA 被瘤胃上皮细胞吸收，为机体提供70%以上的能量需要。而VFA 如丁酸对瘤胃发育成熟起显著促进作用，是瘤胃上皮发育的主要刺激物， 但丁酸过量会产生毒性，尤其是在SARA 条件下［22］。奶牛瘤胃有机酸水平过高，pH 值低于阈值， 诱发瘤胃上皮细胞炎症反应，使上皮促炎相关因子高度表达，奶牛免疫力降低， 引起瘤胃角化不全和上皮损伤。 在VFA被瘤胃上皮吸收过程中，由于上皮受损VFA 的转运相关基因表达受影响， 与此同时影响瘤胃上皮细胞约65%基因的转录［23］。

2.2.1 对瘤胃上皮细胞炎性相关因子表达的影响

Zhang 等［24］通过饲喂奶牛高精料饲粮发现，奶牛瘤胃液pH 值下降诱发SARA，使瘤胃中革兰阴性菌裂解， 释放大量内毒素如游离脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），激发了瘤胃上皮细胞免疫活性与炎症反应， 使促炎相关因子如白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）与瘤胃上皮细胞肿瘤坏死因子（TNF-α）表达量上调。 张瑞阳［25］利用基因芯片技术研究发现，SARA 组与非SARA组奶牛瘤胃上皮细胞有245 个基因存在显著差异， 细胞因子受体与关联通路显著富集后进一步发现， 通路中IL-1β、IL-2、IL-22、 趋化因子配体19（C-C motif chemokine ligand 19，CCL19）、CCL8、趋化因子受体1（C-X3-C motif chemokine receptor 1，CX3CR1）、 趋 化 因 子 配 体6 （C-X-C motif chemokine ligand 6，CXCL6）、TNF-α 表 达 水 平 上调，说明瘤胃上皮细胞发生局部炎症反应。 相关性分析还显示， 瘤胃上皮细胞炎症因子与pH 值和LPS 呈显著相关，且LPS 可明显上调瘤胃上皮细胞中IL-1β、IL-2、IL-8、IL-6 的mRNA 相对表达量，pH 值与TNF-α 的mRNA 相对表达量呈显著负相关，进而表明机体发生SARA 时，可引起瘤胃液pH 值降低，并且LPS 诱导上皮细胞产生局部炎症反应。 局部炎症反应可能会导致细菌破坏机体活性氧 （reactive oxygen species，ROS）平衡，造成上皮细胞氧化应激，激活多个信号分子 通 路 如 核 因 子κB （nuclear factor-κB，NFκB）、 丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen activated protein kinase，MAPK）、核转录因子E2 相关因子2 （nuclear transcription factor E2-associated factor 2，Nrf2），又诱导各种促炎因子如IL-2、TNF-α、IL-6 加剧局部炎症反应［26］，严重时可能促使上皮细胞凋亡。 目前关于SARA 引起瘤胃上皮细胞产生炎症反应的炎性介质相关研究较少，除内毒素外， 组胺是SARA 发生期间另一种炎性介质， 在奶牛中主要是由瘤胃中氨基酸前体物质经过酶的脱羧反应， 或由酮类化合物经脱氨基作用产生的， 其本身不易被瘤胃上皮细胞吸收。 饲喂过多高精料引起SARA 发生时，改变了瘤胃中氨基酸代谢模式，使瘤胃中以组胺为代表的生物胺含量显著升高［27］，导致上皮细胞自噬受到抑制，有害物质累积，进而发生炎症反应。 范古玥等［28］研究发现，奶牛瘤胃上皮细胞雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，m-TOR）自噬通路中部分关键蛋白经组胺刺激后表达量发生变化，其中自噬底物（p62）与磷酸化雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，pmTOR）表达量上升，m-TOR、微管相关蛋白1 轻链3 （microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）表达量下降，因此，组胺过多时可抑制m-TOR 自噬通路， 使瘤胃上皮炎症损伤加重，但m-TOR 自噬通路如何被组胺抑制，造成奶牛瘤胃上皮细胞炎症因子过表达，还有待深入研究。

2.2.2 对瘤胃上皮细胞VFA 转运相关因子表达的影响

奶牛瘤胃上皮细胞膜多为鳞片状结构，SARA使其结构受损，pH 值调节能力与对VFA 的吸收利用能力受到严重影响。 瘤胃上皮细胞存在大量VFA 的转运蛋白， 其中膜转运蛋白（membrane transporters，MT） 和 单 羧 酸 转 运 蛋 白（monocarboxylic acid transporter，MAT） 能有效保持上皮细胞内外的阴阳离子平衡。 王亚洲［29］通过免疫组化法对MT 与MAT 进行定位发现，其在瘤胃上皮组织中大量分布， 可通过对钠离子和氢离子耦合调节瘤胃酸碱平衡， 当SARA 严重时瘤胃上皮组织的MAT 与MT 的mRNA 相对表达量均受到抑制，pH 值降低、 上皮损伤。 调节瘤胃上皮细胞吸收VFA 的相关基因还有腺瘤下调因子（adenoma downregulation factor，ADF）、 阴离子交换剂2（anion exchange agent 2，AE2）、 假定阴离子转运蛋白1（putative anion transporter protein 1，pAT1）等，有学者通过添加高能日粮，降低反刍动物瘤胃液pH值后发现，VFA 升高时其表达量均上调［30］。也有体外研究发现，VFA 含量上升时，瘤胃上皮细胞AE2表达量下调［31］。目前，受SARA 影响的瘤胃上皮细胞对VFA 转运和吸收作用机制并不清楚。

2.3 对瘤胃上皮细胞紧密连接的影响

瘤胃上皮细胞对外界病原菌和毒素的物理抵抗主要因其紧密连接的方式， 紧密连接（tight junction，TJ）主要通过位于基底外侧膜顶端的上皮细胞环状结构在瘤胃上皮形成天然屏障。 SARA引起瘤胃中的革兰阴性菌细胞壁破裂释放大量内毒素，使紧密连接遭受破坏，细胞间隙增大，紧密连接蛋白表达量下调，棘突层线粒体降解，进一步引起上皮细胞的通透性增大。 有学者发现， 增加AMP-激活蛋白激酶 （AMP-activated protein kinase，AMPK）的活性，加速紧密连接组装，从而加强细胞间的紧密连接结构，抑制上皮通透性，增强屏障防御机能［32］。刘军花［33］研究表明，饲喂高谷物日粮后，随着SARA 不断加重，山羊瘤胃上皮角质化过度，对短链脂肪酸的吸收出现障碍，上皮组织中MAPK 信号通路与细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）激活，ERK1/2 磷酸化引起瘤胃上皮细胞紧密蛋白表达量下调， 从而抑制MAPK 或ERK1/2 信号通路，可缓解对紧密连接的损伤。瘤胃上皮细胞的颗粒层与棘突层的紧密连接对调节细胞通透性、防止内毒素侵入起重要作用， 但高谷物日粮诱发SARA 使上皮细胞角质化脱落严重， 颗粒层厚度显著降低， 颗粒层与棘突层的细胞间连接紧密性降低， 并且激活瘤胃上皮细胞的局部免疫反应，TNF-α、TNF-λ 表达量上调［33］，这可能会重新调整紧密连接蛋白的分布使炎症加重。目前，紧密连接蛋白与炎症因子互作的分子机制以及紧密连接的通透性变化关系尚不明确。

3 小结

SARA 是集约化奶牛养殖中极易发生的一种营养代谢病。在生产实践中为了追求高产奶量，饲喂过多精料的现象普遍存在， 从而导致挥发性脂肪酸在瘤胃过度积累， 超过其代谢水平诱发SARA。 SARA 病症具有隐蔽性和滞后性，给养殖企业带来了巨大的经济损失。 通过分析奶牛SARA 易感的几个因素发现，奶牛在泌乳中期、初产时SARA 发病率较高， 且由于遗传背景和饲养模式不同以及择食行为等因素， 奶牛对SARA 的易感性存在较大差异。此外，探究了SARA 对瘤胃微生物菌群变化、瘤胃上皮功能以及VFA 转运相关基因表达的影响， 但SARA 奶牛的瘤胃微生物菌群如何与外界环境进行互作以及如何影响瘤胃上皮基因表达进而影响上皮细胞对VFA 的利用方面的相关报道较少，需要进一步深入研究。