环状RNA 在非小细胞肺癌顺铂耐药中的研究进展

唐瑜琳 何 新

1.赣南医学院第一临床医学院，江西赣州 341000；2.赣南医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科，江西赣州 341000

肺癌是全球发病率仅次于乳腺癌的恶性肿瘤[1]。根据组织学类型，肺癌可分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）。NSCLC 约占肺癌的85%，主要包括肺腺癌和肺鳞状细胞癌。近年来，虽然诊断方法和治疗方法快速发展，但肺癌的5 年总生存率仍然较低[2-4]。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类具有闭合环状结构的新型RNA[5]，广泛存在于各种生物体内，能在表观遗传、转录及转录后等多种水平上对生命活动进行关键性调控[6]。研究显示circRNA在肿瘤组织中表达异常，与肿瘤的发生发展密切相关[7]。circRNA 具有表达量高及在血液、组织液、分泌物中广泛存在的特点[8]。研究表明，circRNA可影响细胞的生长、增殖、侵袭和转移，从而在体外和体内促进NSCLC 的进展。由于其在不同体液中的稳定性，circRNA 有望成为NSCLC 新的诊断/预后生物标志物和潜在治疗靶点[9]。

1965 年，顺铂（cisplatin，DDP）首次被用于抗肿瘤研究[10]。DDP 的抗肿瘤活性逐渐得到证实，广泛用于治疗包括NSCLC 在内的人类肿瘤性疾病[11]。DDP 的作用方式与其与DNA 上的嘌呤碱基交联能力有关，可干扰DNA 修复机制，引起DNA 损伤，随后诱导癌细胞凋亡。然而，由于耐药性和不良反应众多，DDP 的临床应用受到一定限制[12]。

1 circRNA 概述及功能

circRNA 是一组新型的单链、共价闭环RNA 分子，它们不具有3'和5'末端，能够抵抗核糖核酸酶R（ribonuclease R，RNase R）的降解，因而circRNA相较于线性RNA 更稳定、半衰期更长[7]。1976 年Sanger 等在病毒中首次发现circRNA，最初其被认为是剪接过程中形成的副产物，并未引起重视[13]。随后的多项研究表明，在各种物种中均发现或合成circRNA，包括病毒、原核生物、单细胞真核生物和哺乳动物[14]。近年来，由于高通量测序及生物信息分析的快速发展，发现circRNA 在基因表达调控和多种疾病中发挥重要作用[15]。根据来源，目前可将circRNA 分为四类：外显子circRNA（ecircRNA）、内含子circRNA（ciRNA）、外显子-内含子circRNA（EIciRNA）和tRNA 内含子circRNA（tricRNA）[16]。circRNA 的主要功能包括调节亲本基因表达、参与表观遗传调控、充当miRNA 海绵、充当蛋白质“骨架”与RNA 蛋白质结合、参与蛋白质翻译调节、作为翻译模板编码蛋白质等[17]。

2 circRNA 与非小细胞肺癌

研究表明，与癌旁正常组织相比，NSCLC 中的circRNA 表达水平异常。Zhou 等[18]研究发现，circRNA_102179 在NSCLC 组织和细胞中的表达水平高于癌旁正常肺组织。circRNA_102179 通过miR-330-5p 海绵作用正向调节高迁移率族蛋白B3（highy mobility group protein B3，HMGB3）的表达，促进NSCLC 细胞增殖、侵袭和迁移。Liu 等[19]研究发现，与相邻的非肿瘤组织相比，circ_0001649 在NSCLC 组织中的表达显著降低，且circ_0001649 表达较低的患者总生存时间短于高表达者，其表达水平与 TNM 分期、淋巴结转移有关，并通过miR-331-3p 和miR-338-5p 海绵作用抑制NSCLC 进展，提示其有潜力成为评估NSCLC 预后的生物标志物。Wang 等[20]发现一种人第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTEN 基因）衍生的circRNA（hsa_circ_0094342，circ-PTEN），可通过充当miR-155 和miR-330-3p 海绵在转录后增加其宿主PTEN 基因表达，导致致癌的磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路失活。研究表明，PTEN 通过三磷酸磷脂酰肌醇去磷酸化和抑制原癌基因PI3K/Akt 蛋白激酶信号通路，发挥抑制肿瘤的作用[21]。细胞周期蛋白E1 是一种重要的细胞周期调节剂，在细胞周期有序进行中起关键作用，通过定时表达，结合、激活细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶2和增强底物亲和力，在人类恶性肿瘤中发挥重要作用[22]。She 等[23]研究发现hsa_circ_0062389 在NSCLC组织和细胞系中的表达上调，其高表达与晚期临床特征和不良预后相关。Hsa_circ_0062389 敲减后，NSCLC 细胞的增殖受到抑制并停滞在G0/G1期，可作为miR-103a-3p 的内源竞争性RNA 来促进肺癌中细胞周期蛋白E1 的表达，促进NSCLC 进展。

3 circRNA 在非小细胞肺癌顺铂耐药中的作用与机制

3.1 circRNA 与ABC 转运蛋白

ABC 转运蛋白是一类重要的细胞表面蛋白，普遍存在于细胞膜上，负责不同配体的跨膜转运，对维持细胞的正常功能至关重要[24]。目前已在人体发现49 种ABC 转运蛋白，根据其基因组序列和组织结构进一步分为7 个亚组（ABCA～ABCG）。在细胞水平上，ABC 家族的泵调节包括药物在内的多种物质进出细胞的运输，其过表达是导致各类肿瘤细胞毒性药物外排增强和治疗失败的主要原因[25]。ABC 转运蛋白可分为内向转运蛋白和外向转运蛋白[26]。目前发现的药物外向转运蛋白有P 糖蛋白、多药耐药蛋白-1、乳腺癌耐药蛋白、囊性纤维化跨膜调节剂和磺酰脲受体[25]。

既往研究发现，circ-SNAP47 可促进NSCLC 进展并提示预后不良[27]。Zou 等[28]研究发现，circ-SNAP47 主要在细胞质中表达，与NSCLC 细胞（A549、H1299）相比，DPP 耐药细胞（A549/DDP、H1299/DDP）中circ-SNAP47 表达上调，其对RNase R 的降解具有高度抗性，可作为miR625-5p 海绵，而WEE1 是miR625-5p 的直接作用靶点。抑制circ-SNAP47 表达可抑制DPP 耐药细胞的耐药性，表达si-circ-SNAP47 的DDP 耐药细胞中多药耐药相关标志物（包括MDR1 和MRP1）的蛋白表达持续降低。过表达miR-625-5p 可导致耐药细胞中WEE1蛋白表达下调，并诱发化疗敏感性，表明上调miR-625-5p 可抑制NSCLC 的DDP 耐药性。值得注意的是，阻断circ-SNAP47 可使miR-625-5p 上调，并下调WEE1 表达，而抑制 miR625-5p 可抵消circ-SNAP47 下调对WEE1 表达的影响。在裸鼠体内实验得到同样的结果，因而推断circ-SNAP47 可通过吸附miR625-5p 上调WEE1，进而促进DDP 耐药。

Chu 等[29]研究发现，circ_0058357 在DDP 耐药的NSCLC 组织中高表达。使用siRNA 在体外抑制circ_0058357 表达，H1299/DDP 和A549/DDP 中周期相关的细胞周期蛋白D1、迁移相关的基质金属蛋白酶9 和MDR1 水平降低，DDP 耐药的NSCLC 细胞生长、侵袭、迁移受到抑制，同时增加对DDP 细胞毒作用的敏感性和细胞凋亡。通过软件预测circ_0058357 的靶基因为miR-361-3p。miR-361-3p在DDP 耐药的NSCLC 组织中受到显著抑制，而抑制circ_0058357 可提高其表达水平。miR-361-3p 通过与ABCC1 的3'UTR 结合抑制ABCC1 表达，影响H1299/DDP 和A549/DDP 对DDP 的敏感性。此外，circ_0058357 和ABCC1 具有共同的miR-361-3p 结合序列，circ_0058357 通过竞争性结合miR-361-3p 来调节ABCC1 的表达。由此推断，circ_0058357 可通过靶向miR-361-3p/ABCC1 轴恢复H1299/DDP 和A549/DDP 对DDP 治疗的敏感性。

研究发现，circ_PIP5K1A 可通过调节miRNA/mRNA 轴，包括miR-600/缺氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）、miR-142-5p/胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1），促进NSCLC 的发生和发展[30,31]。Feng 等[32]研究发现，在DDP 耐药的NSCLC 组织中circ_PIP5K1A 水平升高，其可通过miR-493-5p/ROCK1 轴调节体内对DDP的敏感性。Shao 等[33]通过生物信息分析预测circ_PIP5K1A 的潜在靶基因为miR-101，后者的目标基因为ABCC1，并通过RNA pull-down 和双荧光素酶报告试验验证了结果。敲减circ_PIP5K1A 可增加对DDP 的敏感性，加速细胞凋亡，而抑制miR-101逆转上述作用。由此推断，敲减circ_PIP5K1A 通过调节miR-101/ABCC1 轴抑制NSCLC 进展并增加DDP 敏感性。

Liang 等[34]发现，敲减circRNA_103615 可降低NSCLC 细胞（A549）对DDP 的耐药性。值得注意的是，在circRNA_103615 敲减后，ABCB1 的表达显著降低，ABCB1 的过表达可逆转circRNA_103615敲减对NSCLC 耐药的影响。因此推断，circRNA_103615 可能通过调节ABCB1 表达作为NSCLC 的关键癌基因和潜在新型生物标志物。

3.2 circRNA 与糖酵解

恶性肿瘤的一个显著特点是代谢异常。研究表明，糖酵解增强可促进肿瘤细胞耐药[35]。Xu 等[36]发现circAKT3 在NSCLC 细胞中表达上调，敲减circAKT3 可提高NSCLC 细胞对DDP 的敏感性，并削弱 HIF-1α 依赖性糖酵解。CircAKT3 与 miR-516b-5p 的表达呈负相关，而与STAT3 的表达呈正相关，miR-516b-5p 抑制剂可逆转circAKT3 敲减对肺癌细胞中HIF-1α 蛋白水平的抑制作用。肺癌组织中miR516b-5p 的表达水平与STAT3 呈负相关，STAT3可与miR-516b-5p 结合，实验表明，miR-516b-5p 高表达明显降低STAT3 水平，而pcDNA-STAT3 的重新引入在一定程度上可逆转这种抑制作用。敲减circAKT3 可显著抑制NSCLC 细胞中circSTAT 的mRNA 和蛋白表达，而过表达STAT3 可逆转这种抑制作用。miR-516b-5p 过表达抑制肺癌细胞中葡萄糖的消耗和乳酸的生成，同时抑制HIF-1α 表达，但过表达STAT3 可逆转这种抑制。从而推断抑制circAKT可抑制HIF-1α 依赖的糖酵解诱导的A549/H1299 细胞耐药。此外，Dong 等[37]研究发现，circ_0076305可通过与miR-296-5p 结合来调节NSCLC 细胞的DDP 耐药性。STAT3 是miR-296-5p 的直接靶点，可解除miR-296-5p 诱导的对DDP 耐药的抑制作用。

3.3 circRNA 与氧化应激

Geng 等[38]发现，相对于正常肺细胞，circCCND1在NSCLC 细胞（A549/HCC827）中表达上调，其表达水平与生存时间、肿瘤分期有关。在DDP 治疗下，敲除circCCND1 显著抑制A549 和HCC827 的细胞活力及增殖能力，同时导致其凋亡增强，即敲除circCCND1 可增加NSCLC 细胞对DDP 的敏感性。运用软件预测得出 circCCND1 的靶基因为miR-187-3p，后者的目标基因为FGF9。在A549 和HCC827 细胞中，circCCND1 与miR-187-3p 表达呈负相关。在DDP 处理下，敲减circCCND1 可使NSCLC 细胞（A549/HCC827）中谷胱甘肽水平和超氧化物歧化酶活性显著升高。研究发现，FGF9 可参与DDP 耐药[39]。Geng 等[38]发现，FGF9 在A549 细胞中被miR-187-3p 模拟物下调，并被miR-187-3p 抑制剂上调。与DDP 处理下的sh-circCCND1-1 细胞相比，miR-187-3p 抑制剂增加A549 和HCC827 的细胞活力，并抑制其凋亡。从而推断circCCND1 可作为miR-187-3p 海绵调节氧化应激和FGF9，进而增强NSCLC 对DDP 的耐药性。

3.4 circRNA 与自噬

Li 等[40]研究发现，circ_100565 在NSCLC 中上调，其高表达与NSCLC 患者较差的总生存呈正相关。circ_100565 的沉默可抑制体外NSCLC 细胞增殖、迁移和侵袭，并减少体内NSCLC 的生长。Zhong等[41]进一步研究发现，circRNA_100565 主要定位于细胞质，具有良好的稳定性，能抵抗放线菌素D 及RNase R 的作用。circRNA_100565 在NSCLC 耐药组织和细胞系（A549/DDP 和H1299/DDP）中上调，其高表达与NSCLC 患者较短的总生存相关。运用软件预测得出circRNA_100565 的潜在miRNA 靶点为 miR-377-3p，后者的目标基因为 ADAM28，circRNA_100565 可作为miR-337-3p 海绵并与其直接作用，负调控miR-337-3p 在NSCLC 细胞中的表达，miR-337-3p 靶向 ADAM28 并负调节其在NSCLC 细胞中的表达。沉默circRNA_100565 则A549/DDP 和H1299/DDP 细胞的增殖受到抑制，促进细胞凋亡。同时还发现敲减circRNA_100565 可抑制 NSCLC 中的耐药细胞自噬。在体内，circRNA_100565 基因下调促进DDP 对NSCLC 的抗肿瘤作用。Kong 等[42]研究发现，与邻近正常组织相比，hsa_circ_0085131 在NSCLC 组织中具有更高的表达水平，其高表达与NSCLC 复发和较低的生存率有关。hsa_circ_0085131 可促进NSCLC 细胞增殖，还能作为miR-654-5p 海绵调节ATG7 依赖的自噬途径在NSCLC 中诱导DDP 耐药。

3.5 circRNA 与缺氧

作为一个重要的肿瘤微环境因素，缺氧在肿瘤的进展和转移中具有重要作用[43]。缺氧可通过改变促存活基因表达来抑制细胞凋亡、使基因组不稳定性、肿瘤新生血管形成、酪氨酸激酶受体下游信号通路增强和上皮间质转化等途径影响肿瘤生物学[44,45]。研究表明，缺氧与药物的化学耐药性有关[46,47]。Yu 等[48]研究发现，circASXL1 在NSCLC 组织中上调。在缺氧条件下，增殖相关蛋白c-myc 和波形蛋白表达增加，E-钙黏蛋白表达下调，A549 和H1299 细胞的迁移、侵袭能力和对DPP 的耐药性增加，miR-206在NSCLC 细胞中表达下调，HIF-1α 蛋白表达显著上调，而敲减circASXL1 后上述作用被逆转，同时circASXL1 敲减诱导低氧暴露下的细胞凋亡。然而，circASXL1 敲减带来的影响可通过miR-206 抑制剂逆转。此外，沉默circASXL1 可通过海绵化miR-206抑制体内肿瘤生长。由此推断敲减circASXL1 可抑制DDP 耐药性、细胞增殖、迁移和侵袭。

3.6 circRNA 与外泌体

程序性死亡蛋白配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）存在于外泌体中，circ-CPA4 可通过靶向let-7 miRNA 调节NSCLC 细胞来源的外泌体PD-L1 的表达[49]。与DDP 敏感细胞相比，经NSCLC 细胞源性外泌体预处理的NSCLC 细胞对DDP 治疗具有更强的耐受性，这种作用可通过与PD-L1 抗体共处理细胞消除。由此推断，circ-CPA4可通过let-7 miRNA/PD-L1 轴调节NSCLC 细胞对DDP 的耐药性。

4 总结与展望

近年来，NSCLC 的诊断和治疗方法不断发展，但DDP 仍然是治疗NSCLC 的一线化疗药物，其耐药的发生是影响治疗疗效的主要原因[11]。越来越多的研究表明，circRNA 在NSCLC 的发生、发展和DDP 耐药中发挥重要作用。随着对NSCLC 耐药研究的不断深入，越来越多的耐药机制被发现，然而目前尚无办法阻止或逆转DDP 耐药。现阶段，研究多聚焦于circRNA 与NSCLC 耐药的关系，相信随着研究的深入，circRNA 在NSCLC 耐药中的分子机制和潜能将被认识，为逆转DDP 耐药提供新的思路。