宫腔灌注改善反复种植失败患者妊娠结局的研究进展

吕海霞，何玉洁

0 引言

近年来，随着体外受精-胚胎移植(Invitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)及其衍生技术不断进步，不孕症患者的临床妊娠率及活产率得到了提高，但仍有一些患者在进行多次胚胎移植后不能成功妊娠，临床称之为反复种植失败(Recurrent implantation failure，RIF)。RIF采用率最高的定义为：年龄小于40岁的不孕症妇女在胚胎质量良好的情况下,经历至少3次体外受精(Invitrofertilization，IVF)(包括新鲜胚胎移植和冻融胚胎移植)或胞浆内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)而未发生胚胎着床或临床妊娠[1]。胚胎质量、子宫内膜容受性是影响胚胎着床的主要因素。胚胎着床被认为是特殊的同种异体基因移植，若子宫内膜免疫细胞数量或者功能紊乱，母体可能对胚胎产生免疫排斥反应，导致种植失败。

近年来母-胎免疫平衡的研究热点多集中在NK细胞、Th1/Th2及Th17/Tregs细胞平衡：外周血NK细胞约占外周血淋巴细胞的5%～10%，具有较高的细胞毒性，对胚胎着床起消极作用。子宫NK细胞(uNK cell)为子宫内膜的主导免疫细胞，可分泌一些细胞因子(如血管内皮生长因子、胎盘生长因子等)，促进血管生成、滋养层浸润、增加子宫动脉血流、促进胎盘发育，对妊娠起积极作用。RIF患者外周血NK细胞数量增多，uNK细胞数量减少[2]。在胚胎种植窗口期，辅助性T淋巴细胞(Th1、Th2、Th17)和调节性T细胞(Tregs 细胞)对母胎免疫起重要作用。Th1细胞介导细胞免疫，产生促炎因子,如白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)，可增加血栓形成风险、抑制滋养细胞生长，不利于胚胎植入。Th2细胞介导体液免疫，产生抗炎细胞因子，如IL-4、IL-6、IL-10，抑制Th1细胞作用，与良好的妊娠结局相关。RIF患者和既往自然流产患者体内Th1/Th2增高[3]。Th17细胞可引起免疫性损伤、感染和炎症，参与母-胎界面的免疫排斥反应。Tregs细胞则具有免疫抑制功能，可分泌多种免疫抑制因子，如IL-9、IL-10及转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)，对抗Th17的细胞效应，诱导免疫耐受。Tregs 细胞数量减少或 Th17/Tregs 比值升高，可作为RIF患者妊娠结局的预测因素[4]。在分子水平上，血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)、胰岛素样生长因子(Insulin like growth factor，IGF)、整合素avβ3、骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)等均对子宫内膜容受性的建立起重要作用[5]。

目前，多种免疫治疗方法可用于改善 RIF 患者子宫内膜容受性及妊娠结局。常用方法：免疫抑制剂(如糖皮质激素、环孢素A等)、免疫调节剂(羟氯喹、静脉注射球蛋白等)、抗凝治疗(阿司匹林、低分子肝素等)、宫腔灌注(粒细胞集落刺激因子、人绒毛膜促性腺激素、外周血单个核细胞、富血小板血浆、生长激素)等。宫腔灌注为一种局部给药方式，可提高子宫局部的药物浓度。本文就宫腔灌注药物改善部分RIF患者妊娠结局的研究进展进行阐述。

1 人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG)

HCG是妊娠滋养细胞产生的一种糖蛋白激素，参与妊娠的众多环节：黄体维持与孕酮生成、血管生成、胚胎着床、滋养细胞增殖分化及母胎界面的免疫调节[6]。近年来多项研究表明，宫腔灌注HCG可改善RIF患者的妊娠结局，但存在争议。Gao等[7]的Meta分析表明,宫腔灌注HCG可提高胚胎着床率、临床妊娠率及活产率。宫腔灌注HCG的最佳时机为卵裂期胚胎移植前5～12 min，HCG的给药剂量不少于500 IU，可显著改善持续妊娠率及活产率[8]。Mansour 等[9]首次在医学文献中证明，宫内注射500 IU HCG在统计学上显著提高了IVF/ICSI的着床率和妊娠率，而给予宫内注射100 IU或200 IU HCG的不孕患者的妊娠结局并没有改善。HCG改善妊娠结局的作用机制可能为：HCG在子宫内膜表面与同源受体绒毛膜促性腺激素受体结合，促进VEGF、LIF、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达，子宫内膜血管生成增加，抑制宫腔内胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGF-BP-1)和巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)的表达[10]。接受宫腔灌注HCG的RIF患者，母-胎界面的Tregs细胞百分比增加，降低母体对胚胎的排斥反应，且HCG可调节Th1/Th2的平衡，也可作为uNK细胞增殖的调节因子。自体外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)可提高子宫内膜容受性，改善妊娠结局，HCG可用于PBMC的活化，增强PBMC的作用。给予RIF患者宫腔灌注HCG，其胚胎种植窗口期的血清孕酮水平明显升高，提高胚胎种植窗口期的子宫内膜容受性、胚胎种植率及临床妊娠率[11]。胚胎滋养细胞分泌的HCG在冻融胚胎过程中可能会有部分损失，因此是否于胚胎解冻周期行宫腔灌注HCG更有意义值得探讨。注射用HCG本身很少发生不良反应，偶有恶心呕吐、腹痛、过敏性皮疹，其安全性尚可[12]。关于宫腔灌注HCG的适应证、改善子宫内膜容受性、妊娠结局的有效性及远期安全性仍有待进一步研究。

2 自体外周血单个核细胞(PBMCs)

外周血单个核细胞由B淋巴细胞、T淋巴细胞和单核细胞等组成。这些细胞可以产生许多细胞因子及趋化因子，提高子宫内膜容受性。2006年，Yoshioka等[13]首次发现宫腔灌注自体PBMCs可提高反复种植失败患者的着床率和临床妊娠率。有动物实验表明，胚胎着床障碍组小鼠的LIF和VEGF的表达与正常妊娠组相比均显著降低，给予胚胎着床障碍组小鼠宫腔灌注PBMCs后，子宫内膜上LIF和VEGF的表达均升高[13]。Yu等[14]研究发现，在解冻周期移植前2 d给予实验组的RIF患者宫腔灌注0.4 ml PBMCs培养液，其临床妊娠率明显高于对照组(34.4%vs. 23.4%)。宫腔灌注后IL-6水平明显升高，TNF-α水平明显降低，且子宫内膜细胞上LIF及整合素avβ3表达增高[13]。宫腔灌注PBMCs改善妊娠结局的机制可能是:使一些细胞因子发生变化，调节机体Th1/Th2平衡；促进滋养细胞侵袭迁移、血管形成，利于胚胎种植。对3次以上植入失败的患者，宫腔灌注PBMCs可改善其胚胎着床率、临床妊娠率及活产率。对于种植失败次数<3次的IVF患者，宫腔灌注PBMCs并不能明显改善活产率[15]。相对于皮下注射受孕者丈夫或其他人PBMCs，宫腔灌注自体外周血单个核细胞无注射部位疼痛、全身排斥反应，感染风险低，来源简单，安全，更易被接受[16]。目前关于PBMCs治疗后不良反应的相关研究较少，暂无重大不良事件报道，其安全性还需大量临床试验来检验。

3 粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)

G-CSF可由骨髓细胞、基质细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等特异性造血细胞产生，一些非造血细胞也可表达G-CSF受体，如内皮细胞、胎盘细胞、滋养层细胞和颗粒黄体细胞[17]。RIF患者及薄型子宫内膜患者由于子宫内膜功能紊乱，其本身产生G-CSF的能力被削弱。宫腔灌注G-CSF可作为一种新型免疫治疗方法，对子宫内膜起免疫调节作用，改善子宫内膜容受性，因此在RIF患者的治疗中受到越来越多的关注。一项随机对照试验表明，在使用HCG促进卵子最终成熟及排卵前每日对实验组RIF患者宫腔灌注G-CSF 30 mIU 1次，对照组给予生理盐水，结果显示,接受宫腔灌注G-CSF的RIF患者每周期的临床妊娠率均高于对照组(37.8%vs. 26.75%,P=0.137)[18]。在Xie 等[19]研究的动物实验中，给予大鼠一侧宫角灌注95%乙醇诱导其子宫内膜变薄，再给予大鼠宫腔灌注30 μg/kg的G-CSF后，大鼠子宫内膜腺上皮细胞标志物细胞角蛋白-19(Cytokeratin 19,CK19)、波形蛋白(Vimentin,Vim)、VEGF及LIF表达增加，子宫内膜厚度增加。宫腔灌注G-CSF改善妊娠结局的机制可能为：使Th1/Th2与Th17/Treg向Th2及Treg转移，产生免疫耐受；宫腔灌注G-CSF可使VEGF表达增加，促进胚胎血管生成，增加子宫内膜厚度；可能抑制外周血NK细胞的数量和功能，对子宫内膜容受性起正向调节；上调子宫内膜容受性标志物的表达如LIF、整合素avβ3等[20-21]。给予RIF患者皮下注射G-CSF同样可提高胚胎种植率及临床妊娠率。一项Meta分析提示：皮下注射G-CSF对RIF患者妊娠结局的影响明显优于宫腔灌注。有研究表明，宫腔灌注G-CSF联合皮下注射G-CSF相较于单纯皮下注射G-CSF更能显著提高RIF患者的临床妊娠率及活产率[22-23]。重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的不良反应普遍较轻微，如注射30 min内的发热、头痛、骨骼肌肉酸痛、食欲不振、一过性肝功能异常、过敏样反应等，可自行缓解。罕见反应有变态反应、支气管痉挛、心力衰竭等。宫腔灌注G-CSF的药物毒性和致畸性尚缺乏研究，但不能完全排除严重不良反应的可能性[24]。目前针对RIF患者G-CSF的给药方式、给药时间、给药剂量、给药次数等的研究较少，暂无统一定论，尚需更多的研究为临床应用提供参考。

4 富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)

PRP是新鲜全血梯度离心后获得的自体血液制品，其血小板浓度为普通血浆的4倍，富含多种生长因子和细胞因子，如VEGF、转化生长因子(TGF)、IGF-I、血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)、IL-8等[25]。子宫内膜环境中充满大量生长因子受体。自2015年起，给予IVF患者宫内输注PRP的临床试验开展，结果显示，接受宫腔灌注PRP治疗后，患者子宫内膜厚度增加，妊娠结局得到改善[26]。宫腔灌注PRP后，子宫内膜欠佳的不孕妇女的子宫内膜厚度及子宫内膜血管信号数量显著增加，周期取消率降低[27]。在 Aghajanova等[28]的研究中，活化的PRP可最大程度促进子宫内膜所有细胞(子宫内膜上皮细胞、子宫内膜间充质成纤维细胞、子宫内膜间充质干细胞和骨髓源性间充质干细胞)的增殖和迁移。不论活化或非活化的PRP均在一定程度上增加了基质金属蛋白酶MMP1、MMP3、MMP7和MMP26的表达，促进子宫内膜再生。第一次自体PRP注射于子宫内膜黄体转化日前3天，每隔3 d可重复1次，宫腔灌注最大次数仅限于3次。宫腔灌注PRP有助于促进子宫内膜再生，增加子宫血流，并缓解子宫内膜炎，改善子宫内膜容受性，不会发生免疫排斥反应。经PRP治疗后不良反应主要为发热、短暂性水肿、瘙痒、疼痛等。所有症状都是轻微的，可自我缓解，无严重不良事件发生[29]。目前，PRP细胞和分子水平上的研究和基础研究仍较少，具体作用机制仍需大量研究阐明。

5 生长激素(Growth hormone,GH)

GH 是垂体前叶分泌的一种由191 个氨基酸组成的肽类激素，具有调节生长、新陈代谢和繁殖的生理功能。生长激素在生殖医学领域主要用于改善卵巢功能，提高卵子质量。近年研究发现子宫内膜上也存在GH受体和IGF-1的表达[30]。宫腔灌注GH后，子宫内膜厚度与子宫内膜容积明显增加，A型(三线型)及B型(等回声型)子宫内膜比例增高，子宫内膜血流阻力降低，血流增加，能改善子宫内膜容受性，提高薄型子宫内膜患者的胚胎着床率及临床妊娠率[31]。GH改善子宫内膜容受性及IVF妊娠结局的机制尚不清楚，可能直接或通过IGF-1介导促进子宫内膜增殖及血管生成，并上调子宫内膜容受性相关的基因表达，如VEGF和整合素β3。在动物实验中经GH治疗的小鼠子宫内膜上皮细胞LIF、整合素avβ3和子宫内膜中的MMP-9表达增加[31-32]。Sbracia等[33]发现，GH在黄体功能不足的女性子宫内膜上的表达降低，提示GH在子宫内膜中的表达可能与孕激素有关[34]。GH增加子宫内膜厚度、提高临床妊娠率的积极效应对于年龄≥35 岁的不孕妇女更显著，也可能是通过提高卵母细胞质量达到了积极的临床效应[35]。目前研究表明，RIF患者、薄型子宫内膜患者及年龄较大的正常反应者可能从GH治疗中受益。肌注 GH或宫腔灌注GH均可促进子宫内膜的再生和修复,增加子宫内膜厚度，改善子宫内膜容受性，提高临床妊娠率,宫腔灌注GH的治疗效果优于皮下注射GH[36]。重组人生长激素治疗的不良反应有水钠潴留，如眼睑及颜面浮肿水肿、关节炎、糖耐量异常、甲状腺功能低下、股骨头滑脱、脊柱侧弯、色素痣、腺样体肥大、手脚变大等。目前尚无证据表明生长激素治疗会增加新发肿瘤或肿瘤复发的风险，不会导致严重不良反应的发生[37]。目前针对GH的两种给药方式、基础研究及作用机制研究较少，且对于患者及其后代的长期安全性仍需进一步研究及说明。

6 干细胞疗法

干细胞是一类具有无限自我更新和多向分化潜能的细胞，分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是一种高度未分化细胞，具有发育的全能性，在医学研究及应用上存在免疫排斥及伦理争议。成体干细胞具有来源广泛、低免疫原性、伦理争议少等特点。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是成体干细胞的重要类型，是目前研究的热点，在基质细胞再生、母-胎界面血管生成和免疫调节中发挥重要作用[38]。许多研究已经在子宫内膜基底层和功能层中发现了子宫内膜干细胞。HOXA10基因在胚胎着床和子宫内膜蜕膜化中发挥重要作用。将骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)注入薄型子宫内膜大鼠模型的宫腔内，大鼠的子宫内膜厚度增加，子宫内膜上波形蛋白、细胞角蛋白、整合蛋白β3、LIF等表达增加，提示宫腔注入BMSCs可改善薄型子宫内膜，可能由于miR-196b对HOXA10基因起负性调节作用，HOXA10进一步促进VEGF、LIF及整合素avβ3的表达[38-39]。有研究对反复种植失败的妇女进行了宫腔内子宫内膜间充质干细胞(Endometrial mesenchymal stem cells,eMSC)移植，子宫内膜厚度由(5.20±1.24)mm增厚至(9.93±0.77)mm，临床妊娠率达79.31%[40]。间充质干细胞可能抑制NK细胞的增殖和功能，其释放的前列腺素E2通过上调 Treg细胞比例、抑制Th1细胞因子的分泌，促进Th2型细胞因子的产生，调节免疫细胞反应[41]。由于干细胞强大的增殖分化潜能，且具有低免疫原性、广谱性，为薄型子宫内膜及不孕患者带来新的希望，但其有效性、安全性、体外诱导和定向增殖所面临的技术问题，仍需深入研究。

7 肉毒杆菌毒素A(Botulinum toxin A，BoTA)

肉毒素是一种肉毒梭状芽孢杆菌产生的细菌内毒素，有A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型7种分型。A型肉毒素既不透过血脑屏障，也不能穿透皮肤，安全且耐受良好，已被广泛用于整形外科和重建外科等领域。Park等[42]研究发现，给予BoTA处理的大鼠，缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor 1-alpha,HIF-1α)及VEGF的表达增加，促进血管生成。最近研究发现，BoTA可增加子宫内膜容受性相关基因mRNA的表达水平，如整联蛋白β3、HIF-1α、血管内皮细胞生长因子受体-2(VEGFR-2)、vim等，促进内皮细胞血管生成[43]。同时，经BoTA治疗后，子宫内膜上皮细胞的子宫内膜容受性相关标志物整合素avβ3、LIF表达水平增加。适宜浓度的BoTA治疗不会诱导子宫内膜上皮细胞的细胞毒性或异常细胞增殖。对子宫内膜容受性降低的RIF患者，BoTA有望成为一种安全有效的治疗方案。

8 展望

目前，反复种植失败的病因、机制尚未完全阐明，一部分患者受益于文中提及的各种治疗及新兴技术，但仍有部分患者疗效甚微。PRP、PBMC、G-CSF和HCG是4种最常用的宫内输注疗法，临床使用率最高，疗效较好。GH研究较少，效果不确切。干细胞是近年来的研究热点，干细胞治疗在临床实践中尚未被广泛采用，因其具有侵入性及治疗成本昂贵，但骨髓活检和细胞存储，对于部分难治性病例可能成为一种非常具有前景的选择。也有部分研究表明，宫腔灌注地塞米松、环孢素A、BoTA等对胚胎着床起负面作用。总之，宫腔灌注药物可能提高反复种植失败患者妊娠率及活产率，这种对妊娠结局的积极作用也可能是由于宫腔灌注操作本身对子宫造成局部损伤诱发。目前，免疫疗法的适应证、剂量、疗程以及疗效等尚无大样本的RCT研究支持，在常规用于临床实践之前，仍需大量的随机对照试验支持。