扶正解毒化瘀方含药血清联合抗菌药物对PA和MDRPA的体外抑菌作用*

王玉婷，王成祥，赵世同

1北京市和平里医院,北京 100013；2北京中医药大学第三附属医院；3首都医科大学附属北京朝阳医院

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是医院常见的病原微生物，具有广泛的致病性，是医院获得性感染中最常见的病原菌之一［1］。PA广泛分布于自然界中［2］，具有可以获得耐抗菌药物基因的能力，因此能够在医院环境中存活，并且易于在患者之间传播［3］。随着临床和农业抗菌药物的泛用和滥用，在自身固有和适应性耐药机制的作用下，部分PA对临床多数常用抗菌药物产生了耐药性［4-5］。多重耐药铜绿假单胞菌（multidrug resistant pseudomonas aeruginosa，MDRPA）的产生使临床选择抗菌药物陷入困境，细菌感染相关性疾病的临床经验抗菌药物疗效不显著［6-7］。因此，充分发挥中医药优势，探索出一种抑制细菌生长的中医药治疗方案，可为治疗耐药菌感染提供新突破口。

扶正解毒化瘀方是基于耐药菌肺炎“正气亏虚、痰瘀互结”的基本病机拟定，前期研究证实其可改善患者临床症状［8］。本研究运用血清药理学及微量稀释法研究扶正解毒化瘀方含药血清联合抗菌药物对PA和MDRPA的体外抑菌作用，以期为该方治疗细菌性肺炎的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株实验菌株由北京中医药大学东直门医院检验科细菌室提供。分别从临床诊断为PA和MDRPA所致肺部感染患者的深部呼吸道分泌物标本中分离、培养、纯化、鉴定所得，传代后置于-80℃冰箱保存备用。质控菌株：ATCC27853。

1.2 药物扶正解毒化瘀方（北京康仁堂药业有限公司配方颗粒）药物组成：黄芩15 g，连翘15 g，漏芦15 g，赤芍15 g，瓜蒌30 g，西洋参6 g，败酱草30 g，薏苡仁30 g等，以上药物剂量为成人1日用药剂量；注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠[特治星，Wyeth Lederle S.R.L.，国药准字J20080077，规格：4.5 g(哌拉西林4.0 g与他唑巴坦0.5 g)]。

1.3 动物SPF级SD大鼠，雌雄各半，6～8周龄，体质量170～200 g，60只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，适应性喂养1周。动物实验在屏障环境实验室进行。

1.4 试剂与设备MH琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基（赛默飞世尔生物化学制品有限公司）；营养肉汤（赛默飞世尔生物化学制品有限公司，OXOID CM1168，1377374）；BDPhoenix-100 System型全自动细菌分析仪（美国BD公司，BD Phoenix）；LHS-250 HC-11型恒温恒湿培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；DDHZ-300型恒温振荡器（苏州培英实验设备有限公司）；321A型台式低温离心机（北京白洋医疗器械有限公司）；Multiskan MK3型酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 含药血清制备SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，随机分为中药大、中、小剂量组和空白对照组，每组10只。中药大、中、小剂量分别对应人临床等效剂量的8倍、4倍、2倍，连续给药5天，每天2次，末次给药后1 h将各组大鼠麻醉后予腹主动脉采血，离心后获得含药血清，56℃水浴灭活后分装，-80℃保存备用。

1.5.2 菌悬液制备采用麦氏比浊法，将活化的PA和MDRPA配制成1×107CFU/mL浓度的菌液，现用现配。

1.5.3 中药含药血清及其联合特治星的最小抑菌浓度（MIC）测定参考美国临床和实验室标准化协会（CLSI）发布的抗菌药物药敏试验用微量肉汤稀释法（M100-S24，USA，2014）［9］，分别测定不同浓度含药血清对PA和MDRPA的MIC，并与特治星联合使用测定MIC，同时与特治星的MIC进行比较。

1.5.3.1 扶正解毒化瘀方含药血清和空白血清体外抑菌实验分组：空白血清组及小、中、大剂量含药血清组。取96孔板，用梯度稀释法在每行1～8孔中分别加入含药血清80、70、60、50、40、30、20、10 μL，再用营养肉汤补齐至200 μL；在9、10孔中直接加入200 μL肉汤；将活化后的浓度为1×107CFU/mL的PA、MDRPA、ATCC27853菌悬液10 μL加入1～9孔中，最终接种菌量约为5×105CFU/mL；9孔为阳性对照，10孔不加菌液，为阴性对照；上述操作重复3次，37℃恒温恒湿静置培养18～24 h，酶标仪（single，570 nm）检测相应光密度（optical density，OD）值。

1.5.3.2 特治星及其联合含药血清对PA和MDRPA的体外抑菌实验配制4096 μg/mL（按照哌拉西林量计算）的特治星溶液备用；对特治星原液进行对倍稀释，第1孔初始浓度为2048 μg/mL，稀释成11个浓度梯度；将上述稀释后的特治星溶液分别加入到相应96孔板的1～11孔中，每孔100 μL；1～11孔中再分别加入60 μL的肉汤及40 μL血清，12孔加200 μL肉汤；将活化后的浓度为1×107CFU/mL的PA、MDRPA、ATCC27853菌悬液10 μL加入1～9孔中，最终接种菌量约为5×105CFU/mL，12孔不加菌液，为阴性对照。上述操作重复3次，37℃恒温恒湿静置培养18～24 h，酶标仪（single，570 nm）检测相应OD值。

1.5.4 特治星及其联合含药血清的抑菌作用测定（K-B纸片法）分组：特治星组、特治星+空白血清组、特治星+2倍血清组、特治星+4倍血清组、特治星+8倍血清组、特治星+中药组临床等效中药水提物。将活化的菌株使用比浊仪配制成0.5麦氏单位的菌悬液；用无菌棉签浸入配制好的菌液，用拭子划线整个MH琼脂培养基，从平板顶部到底部，均匀涂布，每次旋转平板约60°，涂抹3次，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止菌悬液流动，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。按照预先设定的分组，将抗菌药物纸片贴于已接种细菌的琼脂表面。37℃恒温恒湿孵育18～24 h，使用游标卡尺测量抑菌环的直径。

1.6 统计学方法采用SPSS 20.0分析数据，方差齐采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法；方差不齐采用Welch近似方差分析，多重比较采用Dunnett’S T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中药含药血清及其联合特治星的MIC测定（微量稀释法）中药颗粒剂含药血清无明显抑菌作用。与空白血清联合特治星比较，中药含药血清联合特治星不能显著降低PA的MIC；中药2倍、4倍含药血清联合特治星不能降低MDRPA的MIC；中药8倍含药血清联合特治星能降低一个梯度的MDRPA的MIC。ATCC27853特治星的MIC是2 μg/mL。见表1。

表1 各组对PA及MDRPA的体外MIC μg/mL

2.2 特治星及其联合含药血清的抑菌作用测定（K-B纸片法）从恒温恒湿培养箱中取出过夜孵育的固体培养基，观察细菌生长情况，采用游标卡尺测量各组抑菌环的直径。见表2。

表2 各组抑菌环直径（K-B纸片法） mm

3 讨论

体外抑菌试验作为基础研究方法，是抗菌药物研究过程中重要的试验手段和关键环节，被广泛应用于药物的筛选、临床药敏试验、抗菌谱效价测定及活性物质的追踪等研究领域，是评价药物抗菌效能较经典也是最直接的研究方法［10］。目前在中药体外抑菌作用研究中稀释法和纸片法是最常应用的研究方法。

在中医药的研究中，无论中药单药还是中药复方，在抑菌、杀菌方面都积累了丰富的经验，而且在临床细菌感染相关疾病的治疗中发挥重要作用。有研究表明蒲公英、黄连、夏枯草、五倍子、乌梅、丝瓜络等中草药对PA有一定抑菌作用［11-12］，中草药衍生物黄芪多糖有抗呼吸道PA感染的功效［13］。在联合用药方面金银花能增强庆大霉素的体外抑制PA效果［14］，中药复方芪归银方提取物可降低多种抗菌药物的MIC［15］。由于中草药所含成分复杂多样，无论对单药还是复方体外抑菌作用的研究干扰因素较多，药效物质基础不明确，药理作用机制和代谢过程等问题难以做出清楚解释，因此很难对中药体外药效学作出客观评价［16］。上世纪80年代初，日本著名药理学家田代真一首次提出“血清药理学”。他认为中草药制剂口服进入体内后经过胃肠道的消化以及内环境菌群的代谢和排泄等过程而发挥治疗作用，因此中草药制剂作用于人体的药效物质基础是机体生物转化的产物，这些产物被吸收入血后与血浆蛋白相结合，通过血液循环作用于不同组织或器官［17］。国内学者王喜军在上世纪90年代便提出了“中药血清药理学”，为中医药药效学研究开创了新思路，相比于直接用传统中草药制剂干预的体外试验，含药血清的生物活性更加合理，其结果更具可信度。将中草药药剂通过灌胃方式给药，经过动物的消化、吸收、代谢等过程，使得其含药血清能更直接地反映中草药制剂的药理作用，并能够更科学地对中草药制剂的疗效和机制进行阐述。但针对体外抑菌试验，含药血清作为干预因素也存在较多缺陷。含药血清成分复杂，不仅存在一定的渗透压，其中还包含许多有助于细菌生长的营养物质，对试验结果有一定干扰。本研究参考2014年CLSI发布的抗菌药物药敏试验，建立了方便、快捷、易操作的微量肉汤稀释法。本研究发现，单一的中药含药血清未体现出明显体外抑菌作用。对于PA，与空白血清联合特治星比较，中药含药血清联合特治星不能显著降低MIC值。对于MDRPA，与空白血清联合特治星比较，中药2倍、4倍含药血清联合特治星不能降低MIC值，而中药8倍含药血清联合特治星能降低一个梯度的MIC值。提示含药血清能够一定程度敏化MDRPA，降低特治星对MDRPA的最小抑菌浓度，但有效的药物浓度较高，远远超出了临床等效剂量，对临床治疗有一定的指导意义，但与临床用药规范不符。

纸片法是通过药物在琼脂上扩散抑制其周围细菌的生长而形成抑菌环圈，根据对应抑菌圈直径的大小判定细菌对某药物的敏感性，可分为敏感、中介、耐药。本研究结果显示扶正解毒化瘀方不同浓度含药血清或中药水提物与特治星对PA及MDRPA并无明显联合抑菌作用。此结果与微量肉汤稀释法的结果存在一定差异。考虑纸片扩散法试验中抑菌圈的直径大小受诸多因素影响，如培养基质量、细菌接种量、药敏纸片质量、纸片含药的准确性和均匀性等，且含药血清本身成分复杂，是细菌生长的较好营养物质。因此，尚需进一步优化抗菌药物联合含药血清的K-B纸片法试验细节，进一步探索扶正解毒化瘀方及其含药血清在K-B法中的体外抑菌作用。

综上所述，本研究得出高浓度扶正解毒化瘀方含药血清有一定体外抑菌作用，可一定程度恢复MDRPA对TZP的敏感性，可能存在延缓甚至逆转PA耐药性的作用，为扶正解毒化瘀方可能干预PA耐药机制体现疗效的假设提供了研究基础，并对临床耐药菌感染性疾病的治疗提供了新思路。