血管拟态在恶性肿瘤中的争议及其意义

时 欣, 陈 珏

(1. 扬州大学医学院附属泰州市第二人民医院 肿瘤科, 江苏 泰州, 225500;2. 扬州大学附属医院, 江苏 扬州, 225000)

1 前 言

血管拟态(VM)是发生于实体肿瘤内的无内皮细胞参与的血管结构，由肿瘤细胞独立形成，为肿瘤细胞提供氧气和营养[1]。尽管众多学者在多数实体瘤样本中检测出VM，并证明其与肿瘤的不良预后相关，且近年来大量的基础研究也证实了VM的形成及其相应机制，但学术界仍存在众多争议。本研究针对VM相关的争议性话题进行回顾性综述。

2 血管拟态的定义及功能

VM用于描述肿瘤细胞“模拟”内皮细胞，形成管状结构并承载体液传导功能的过程。作为一种病理性肿瘤血管, VM具有供氧、营养转运和转运细胞代谢废物的功能[2]。在肿瘤早期尚无内皮依赖性血管长入的阶段，上述功能是侵袭性肿瘤早期生长进展的关键保障。目前对VM血管的结构定义为: 肿瘤细胞与周围富含糖蛋白的基质膜共同形成的管状结构，内部可见循环细胞[3]。内皮依赖性血管和VM可以根据结构和成分的差异进行CD34/31-PAS的染色以识别和区分，这一方法已成为VM检测的标准方式。

3 血管拟态的病理结构争议

自从1999年VM概念首次提出后，多数学者已接受VM这一观点，而部分学者则对此持质疑态度，认为VM只是发生在肿瘤内部的一种空腔结构，为误判的血管结构。一般认为, VM的存在是通过肿瘤内过碘酸雪夫染色(PAS)阳性且内皮细胞标记阴性的血管样结构而推断的。因此, VM被认为是一种独立于血管生成之外的肿瘤灌注途径。然而，有学者[4]质疑这仅仅是肿瘤内皮细胞结构不稳定和微出血引起的血液积聚的“伪影”结果，认为VM仅仅是组织获取养分过程中产生的“血池”。但是“血池”与VM确实存在差异。如果VM是光镜下观察到的血池，那么红细胞就不会被封闭在PAS及管道结构中。部分研究[5]基于肿瘤横切面上的管腔空间假设VM的存在，但是不存在PAS及边界。同样，弱PAS染色可以排除基质膜的存在，从而判断为血池[6]。研究[7]报道在多数实体瘤样本中存在含有红细胞的PAS(+)/CD31(-)结构。这些研究证明了VM[PAS(+)/CD31(-)]和血管[PAS(+)/CD31(+)]在同一区域内的存在。SCULLY S等[8]及其同事对胶质母细胞瘤的研究显示, CD31、CD34和/或血管内皮(VE)-钙黏蛋白阳性(内皮依赖性血管)和阴性(VM)管腔结构的存在; 这项研究还表明，内皮依赖性血管呈现α-平滑肌肌动蛋白阳性，而VM结构中则表现为阴性。这些文献证明实体肿瘤中存在VM。

4 血管拟态的检测标准

目前为绝大部分学者所接受的VM检测为内皮细胞表面标记物CD31或者CD34的免疫组化染色联合基质膜的PAS化学染色，在此基础上确认观察到含有红细胞的PAS(+)/CD31(-)的空腔结构为VM。然而，部分学者对此尚有争议。肿瘤细胞具有分泌大量黏蛋白的能力，由此造成PAS染色阳性，但这并不意味着它们正在形成管状结构。MANIOTIS A J等[9]通过电镜扫描证实VM内部存在血液成分。因此，在缺乏可靠的VM生物标志物的情况下, PAS(+)和经典EC标志物(如钙黏蛋白、CD34或CD31)的结合，加上明确定义的管腔中的红细胞，应该是目前VM检测的最佳标准。

5 血管拟态的临床意义

大量研究[10]表明VM与肿瘤患者生存率的降低有关，VM在肿瘤组中的检出往往提示较短的总生存期(OS)或无进展生存期(PFS)。一项Meta分析研究[11]比较了20种不同病理类型肿瘤中VM(+)和VM(-)的OS水平，除滑膜肉瘤外，其余19种肿瘤证实VM(+)与OS降低有关，其中卵巢癌和结直肠癌中VM阳性对生存期的影响最明显。在眼眶横纹肌肉瘤和肾上腺皮质样癌中同样观察到类似的差异[12-13]。有PAS(+)结构的胃癌患者易出现较高的组织学分级、转移、远处复发和OS下降[14]。同样, VM(+)前列腺癌患者与Gleason评分、术前前列腺特异性抗原(PSA)水平、病理分期、淋巴结转移和远处转移相关。迄今为止，关于VM与其临床价值的研究主要集中在中国人群，部分分散性研究则涉及欧洲、日本、北美和泰国人群。肿瘤发病率及肿瘤类型在特定人群中具有明显的差异，因此在扩大人种情况下VM对肿瘤预后的影响需要进一步研究。总之，目前多数研究认为VM常见于高度侵袭性肿瘤，并与不良预后相关。因此，针对这一特异性细胞亚群的深入研究可能有助于改善患者的生存获益。

6 血管拟态在不同肿瘤中的阳性检测率

并非所有恶性实体肿瘤都能检测出VM。研究[15]显示，由于肿瘤病理类型的差异以及研究标准的差异, VM在不同病理类型恶性肿瘤中的阳性检测率在5.0%～65.0%; VM的平均阳性率约为29.0%, 其中胶质母细胞瘤在所有肿瘤类型中的检出率最高(65.9%), 同时胶质母细胞瘤患者的VM类型也具有显著的异质性。有研究报道胶质母细胞瘤患者样本中VM(+)检出率为65.9%, 然而两个类似的研究报告胶质母细胞瘤中VM阳性率为26.0%[16]和16.0%[17]。显然，患者和/或肿瘤特征(如肿瘤分期或组织学分级)可能是导致VM阳性率的影响因素。

7 体内争议之VM的动物模型

在所有体内肿瘤模型中，小鼠异种移植是VM研究的标准。在一项基础研究[18]中，将人乳腺癌细胞移植于小鼠皮下，通过苏木精-伊红(HE)染色，可能会导致将VM误解为肿瘤内出血引起的血池。同样，在前列腺小鼠皮下移植瘤中，利用HE染色联合PSA染色将内皮依赖性血管误判为VM[19]。有研究[3, 20]首次使用PAS(+)/CD34(-)组合在B16黑色素瘤小鼠皮下移植模型中，该研究证实了PAS/CD34双染色结合管腔中红细胞的存在这一经典方法在VM判断中的价值，为后续VM的研究提供了标准参考。在此研究之后，多个研究[18, 21]报道PAS(+)/CD31(-)或PAS(+)/CD34(-)(VM)结构，这些研究提供了PAS(+)/CD31(-)染色结构的确凿证据，这些结构的管腔中也含有红细胞。然而，在某些情况下，低质量或低分辨率图像未能证明红细胞的状态或存在。

目前尚无体内鉴定VM的方法。PAS(+)染色不能保证VM的存在，因此迫切需要区分VM和血池的新的生物标志物。作为潜在的生物标记物, BAJCSY P等[22]使用3D Z-stack重建来识别转移性眼色素层黑色素瘤样本中的层黏连蛋白和CD34的肿瘤内结构。最近的一项研究使用泛层黏连蛋白抗体和EC结合凝集素来鉴定人胶质母细胞移植瘤中的VM结构[23], 该研究证明了凝集素阳性管状结构的存在。上述结果表明，这些管状结构的黏蛋白含量和组成可能有很大差异。因此，未来的研究将致力于识别CD31(-)血管内的特异性黏蛋白，可能是特异性凝集素或其他细胞外基质(ECM)成分，从而改进目前的VM识别方法。

8 VM形成的分子信号

8.1 基质金属蛋白酶(MMPs)与细胞外基质成分

许多研究提示MMPs在VM中的作用。SOOD A K等[24]首次证明VM(+)与卵巢癌样本中金属蛋白酶MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-14的表达存在相关性。这些研究也报道了VM(+)与层黏连蛋白-5T-2的关系。MMPs和层黏连蛋-5T-2是黑色素瘤形成VM必需的蛋白结构[25]。在前列腺癌中，VM(+)与层黏连蛋白和整合素α6β1相关[26], 在间皮肉瘤和肺泡横纹肌肉瘤中与Ⅳ型胶原纤维相关[11]。2008年DEMOU Z N[27]报道VM(+)与整合素α3亚单位的存在有关。由于体外VM仅发生在ECM替代物上，因此可以合理地假设该过程需要通过MMPs进行ECM重塑。

8.2 PI3K-AKT通路

HESS A R等[28]研究首次涉及PI3K-AKT通路与VM的关系。随后，该研究团队提出黏着斑激酶(FAK)参与VM形成的分子机制。FAK是PI3K通路的上游成分和整合素信号通路的重要成分[29-30]。两项相关研究[31-32]表明, VM结构分别与黑色素瘤和胆囊癌中的AKT[31]或MMPs、PI3K、FAK[32]相关。目前。学术界已普遍认为, PI3K通路是VM形成的确切分子信号，这也为将来干预治疗的可能性提供了机会。

8.3 血管生成信号通路

由于VM是肿瘤细胞模拟血管内皮细胞产生具有循环功能的血管样结构，因此多数学者猜测它们具有共同的信号通路。然而, VM与血管生成的关系是一个有争议的话题。研究[8, 18]报道血管生成信号通路在VM中起作用, VM(+)与肿瘤标本中血管内皮生长因子(VEGF)或血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ)的表达相关。另一个与VM相关的因子是缺氧诱导因子1α, 其广泛参与促血管生成途径的相关分子信号的刺激与活化[33-34]。然而，与此形成鲜明对比的是，一些报告[23, 35-36]表明抗血管生成治疗如抗血管内皮生长因子或其受体的治疗对VM形成没有影响，甚至会促进VM的形成，这表明血管生成与VM形成过程中活化信号的不一致性。事实上，在抑制血管生成信号过程中可能会诱导促VM信号，这些信号能够促进肿瘤细胞的表型转变及恶化[32, 37-38]。显然，目前对VM及血管生成中的共同信号通路尚缺乏精确的研究依据。

9 其他信号通路

抗体抑制实验[39]表明，组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)在体外是VM所必需的，阻断TFPI-2可以抑制MMP2的激活。但这是否表明凝血级联参与VM, 或这些蛋白质的非稳态作用可能参与了VM的信号活化，具体的分子机制尚需要进一步研究。鉴于VM是一种具有循环功能的管状结构，VE钙黏蛋白(VE-CAD)与VM的相关性也在多数研究中有所报道[40]。VE钙黏蛋白是血管内皮细胞[41]中稳定表达的跨膜蛋白。HENDRIX M J C等[42]研究证实了VE-CAD在黑色素瘤细胞VM形成中的作用。有研究[43-44]报道，在黑色素瘤中VE-CAD促进血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1)信号传导，进而促进PI3K/PKC通路的信号活化，对VM的信号启动至关重要。Wnt信号通路和上皮细胞-间充质转化(EMT)通常与肿瘤、血管生成和发育有关，也与VM的形成有关[45-46]。Wnt3a和β-连环蛋白被证明能增加结肠癌中VM的形成[47]。肿瘤细胞的上皮间质转化是肿瘤细胞恶性表型转变的一种方式，研究[48-49]证明EMT参与VM形成，在EMT过程中, Slug、Snail和Twist被证实与VM形成相关。

10 小 结

抗血管生成目前被广泛应用于实体瘤的治疗，并给患者带来了实质性获益。然而，抗血管生成往往不单独使用，在抑制肿瘤生长方面尚缺乏有力证据，这可能与肿瘤细胞通过替代/代偿途径、血管协同或VM形成[37]来补偿血管生成抑制有关。作者推测VM在肿瘤的发生和抗血管生成治疗的逃逸中起着关键作用。研究VM发生的确切分子机制，有助于开发生物标记物、药物发现和对抗血管生成难治性患者进行更有效的治疗。