骨修复缓释微球的应用进展

马博，顾勇，陈亮

(苏州大学附属第一医院骨科，江苏 苏州 215006)

骨骼是人体的组成器官，具有保护和支持身体的重要功能。一般来说，骨组织具有良好再生能力，可以自我修复并持续进行生理性改建。然而，当机体处于一些较恶劣的状态时，比如急慢性炎症、创伤、骨肿瘤，以及一些先天性的疾病时(如发育畸形等)，就很难通过骨骼进行自我修复，造成损伤处长期的疼痛、活动异常、畸形、肌肉萎缩和负重功能丧失。因此，针对骨损伤修复材料的研发一直是热点[1-2]。目前，一些人工合成的材料如生物陶瓷、生物玻璃、骨水泥等，已经应用于临床实践。而从20世纪50年代开始，微球作为一种新的生物材料形式，逐渐引起人们的注意。它是一种体积为几十到几百纳米之间的微型球体，其常用的组成材料为聚乳酸、壳聚糖等聚合物，以及一些其他的有机或无机材料，如碳酸钙、二氧化硅等。20世纪到90年代多孔微球被确定适合作为药物载体、细胞输送和组织再生的潜在应用材料[3]，由于其体积微小，可以深入到骨骼创伤间隙，同时具备良好的孔隙和可降解性，以及对药物及生物活性因子等的缓释作用，大大降低了对新生骨骼修复过程的干扰，现已越来越多地应用于骨损伤修复中。

1 微球的特征

1.1 微球的大小 微球的直径大小一般为几十微米到几百微米之间。Sheikhi等[4]制备的gelma微球，通过改变gelma溶液内相与油相外相流量比和gelma溶液浓度(7%、10%和20%)，获得直径为70～115 μm的gelma微球，可以适应不同的需要。Lin等[5]通过改变微球的大小来控制微球中的蔗糖乙酸异丁酸酯的释放速率，证实了微球大小对其性能的重要性。

1.2 微球的孔隙 多孔微球表面有外孔或核心有内孔，孔径是决定生物分子吸附和释放的重要因素。活性物质可以溶解或分散在微球的表面或核心。多孔材料按孔径可分为：微孔材料(<2 nm)、介孔材料(2～50 nm)、大孔材料(50～200 nm)和超大孔材料(>200 nm)。与传统的微球相比，多孔微球具有更出色的药物吸附和释放功能、较大的比表面积和较低的密度等特点。Kunliang等[6]以卡拉胶、正己醇和超顺磁性纳米氧化铁为原料，制备了一种新型多孔微球，具有出色的盐酸阿霉素负载量和释放性能，在癌症的治疗中具有很大的潜力和竞争力。Xi等[7]通过设计一种具有“莲子荚面状”的多糖止血微球，微孔内部相互连通，具有快速止血性能。

1.3 微球的缓释性能 微球体性质稳定，其多孔微观结构有助于进行药物装载和释放，因此可作为载体负载各种药物，以实现药物长期输送功能，这对于一些需要长期作用的药物具有较好的实用价值。Luo等[8]采用溶剂热法合成了多孔TiO2微球，具有多孔的表面形貌和较高的载药能力，将其添加到复合骨水泥中，实现了药物(如庆大霉素)的缓控释性能。Chen等[9]制备了聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]-硅酸钙(CaSiO3)-阿司匹林的复合微球支架，对阿司匹林具有优异的缓释作用，有望作为一种新型成骨材料。

1.4 微球的生物相容性与生物降解性 具有生物活性的微球不仅应具有粒径小、多孔、流动性好的优点，还应具有良好的生物相容性与生物降解能力，以免对微球的生物应用带来很大的影响。Bian等[10]通过将GelMA微球共价偶联活性肽APETx2再进一步携带髓核细胞，成功提高了材料的生物相容性，使得髓核细胞在酸性条件下的存活能力增强。Annamalai等[11]通过静电相互作用，设计出有效掺入生物活性骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)的明胶微球，通过响应巨噬细胞介导的骨愈合的炎症阶段来触发微球降解，控制生长因子进而促进骨再生。Zhao等[12]在高温下制备了新型的可生物降解、均匀的羧甲基几丁质微球，在临床上作为一种新型的可吸收止血材料具有很大的潜力。

2 微球在成骨方面的应用进展

2.1 微球与无机离子的结合应用

2.1.1 钛离子 随着对纳米材料越来越多地研发，近来许多研究表明纳米二氧化钛(TiO2)可以促进骨髓间充质干细胞的生长与加速其成骨分化，进而提高骨缺损部位的成骨速率和成骨能力[13]。Khoshroo等[14]制备了聚己内酯(polycaprolactone，PCL)/TiO2烧结微球支架，将TiO2纳米管引入到PCL支架中，改善了单纯PCL支架的力学性能、生物学性能以及骨组织工程应用的理化性能。Wang等[15]通过将二氧化钛纳米粒子结合到聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球中，显著地增强了微球的成骨诱导能力。

2.1.2 铁离子 铁离子作为天然骨所包含的微量元素之一，对于骨代谢具有重要作用。已有研究表明，由铁离子修饰后的TiO2涂层的生物相容性较之前提高，可以更好地提升涂层的成骨效应[16]。Zhang等[17]通过Pickering乳液设计了氢氧化铁(Fe(OH)3)纳米粒子包裹的聚乳酸-羟基乙酸共聚微球，然后烧结成多孔微球支架，将重组人BMP-2通过聚多巴胺涂层固定在支架上。结果表明，在含有纳米Fe(OH)3的支架上培养的小鼠骨髓间充质干细胞具有较好的增殖、成骨分化和迁移能力。Guo等[18]利用水热法合成了磁性介孔碳酸化羟基磷灰石CaCO3/Fe3O4微球，具有更好的药物缓释性能，在骨植入给药方面具有很大的应用潜力。

2.1.3 锂离子 锂离子是Wnt经典通路的激活剂，已有关于含有锂离子的支架可以促进牙骨质再生的研究报道。Li等[19]制备了锂/纳米羟基磷灰石/明胶微球/重组人促红细胞生成素复合支架，可以通过锂激活Wnt信号通路和促红细胞生成素上调缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)/血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通路，有效提高了骨髓间充质干细胞的成骨作用和血管内皮细胞的血管生成作用，促进了骨缺损的修复。

2.1.4 镁离子 镁是体内含量比较丰富的阳离子之一，主要存在于骨骼和骨骼肌中，在体外表现出促进成骨分化的倾向。多项流行病学研究表明，低饮食镁与骨质疏松症之间存在一定关联。同时，研究证明高浓度的镁离子也会削弱成骨细胞的活性[20]，所以控制体内镁离子浓度处于适当水平对于骨骼的健康发育至关重要。Lin等[21]设计了由聚乳酸-乙醇酸生物聚合物、海藻酸盐水凝胶和氧化镁纳米粒子组成的单分散微球给药系统，通过可调节的表面微孔网络精确控制Mg2+的释放，使镁离子处于合适的浓度，能有效地提高其成骨活性，表明控制Mg2+精确释放在临床上应用于原位骨再生具有良好的研究前景。Yuan等[22]构造了一种包含淫羊藿苷和MgO/MgCO3的PLGA微球，实现了Mg2+与淫羊藿苷的共同释放，起到了促进成骨的作用。

2.1.5 钙离子 骨骼的负重功能与骨骼的结构和矿物质含量息息相关，而钙作为骨骼内主要的无机盐离子，其摄入量的稳定对于骨骼的生长、维持具有重要意义。近年来，关于羟基磷灰石和白锁石为代表的含钙生物陶瓷的研究越来越多。Jose等[23]将羟基磷灰石纳米粒子和白锁石纳米粒子分别掺入PLGA微球中，通过表面烧结将复合微球转化为具有足够机械强度和特定形状的骨移植材料，将来有望应用于骨移植和组织工程。Daneshmandi等[24]将过氧化钙(CaO2)封装于PLGA微球中，证实了CaO2的代谢产物O2、Ca2+以及H2O2的释放提高了小鼠血管化骨再生的能力。

2.2 微球与天然高分子材料的结合应用

2.2.1 人参 人参化合物是人参或者人参皂苷在哺乳动物体内的代谢产物，具有抗癌、抗氧化、抗糖尿病、抗脂肪细胞、抗炎和保肝特性等多种功能[25]。Guo等[26]就曾将人参皂苷Rg1负载于海藻酸盐-壳聚糖微球上，促进人骨髓基质细胞(human bone marrow stromal cells，hBMSC)的增殖和分化，抑制缺氧后-复氧诱导的hBMSC凋亡。Thangavelu等[27]通过静电作用制备了含人参化合物K的双相磷酸钙-壳聚糖微球，结果显示，含有人参化合物K的微球支架有利于成骨细胞样细胞系(MG63)的附着；并且，微球支架在大鼠骨髓干细胞中的成骨基因表达显著增强，说明这种新型微球支架系统有望成为新型的骨再生材料。

2.2.2 琼脂糖 琼脂糖具有线型结构，有着可逆的热凝胶行为、出色的机械性能和较高的生物活性，因此，琼脂糖在构造先进的药物递送系统方面受到广泛关注[28]。Hasan等[29]通过琼脂糖强化双相磷酸钙和双相硫酸钙制备了复合微球，并对其用于骨再生，结果表明，这种微球有利于细胞黏附和增殖、对新骨形成具有促进作用，在骨替代应用方面具有巨大的潜力。Annamalai等[30]利用琼脂糖基质包裹人骨髓间充质干细胞和Ⅱ型胶原蛋白，再采用油包水的方法形成微球，研究证实可以增强人骨髓间充质干细胞的软骨分化。

2.2.3 柚皮苷 柚皮苷存在于中草药和柑橘类水果中，具有广泛的药理活性，包括抗炎、抗癌活性，以及对骨再生、代谢综合征、氧化应激、遗传损伤和中枢神经系统等的生物学作用[31]。Yang等[32]在单分散的柚皮苷微球中加入醋酸异丁酸酯，明显减少了柚皮苷的突释，具有良好的生物相容性和体外成骨能力。Guo等[33]将包裹柚皮苷的壳聚糖微球负载到含有小白菊内酯的多孔PLLA支架网络上，延长了柚皮苷的释放时间，同时相较于单纯的PLLA网络，进一步提高了支架引导骨再生的能力。

2.2.4 细菌纤维素 细菌纤维素是一种来源于细菌的纳米纤维材料，具有高结晶度和聚合度、高表面积、高柔韧性、高吸水能力等，近年来被广泛开发应用伤口愈合、人造皮肤、硬脑膜假体、动脉支架涂层、软骨和骨修复植入物等再生医学领域[34]。Zhang等[35]采用Malaprade反应和Schiff碱反应，构建出了胶原/细菌纤维素复合微球，并且进一步通过反相悬浮法制备负载生长因子BMP-2，构建出了具有多级结构和组成的三维支架多孔微球，具有良好的生物相容性，能有效促进小鼠MC3T3-EL细胞的黏附、增殖和成骨分化，为胶原/细菌纤维素多孔微球在骨组织工程领域的应用提供了理论依据。

2.3 微球与药物的结合应用

2.3.1 利福喷丁 骨关节结核是一种古老的慢性消耗性疾病，绝大多数是由结核分枝杆菌引起的。利福喷丁是一种半合成的福霉素类抗生素，对潜伏性结核感染具有良好的效果。Wang等[36]制作出了利福喷丁-聚乳酸缓释微球用以治疗骨关节结核，具有使利福喷丁的给药系统更稳定，缓释时间更长，良好的生物相容性、骨传导性和骨诱导性，为临床治疗骨关节结核提供了一种新的治疗策略。Liang等[37]设计了一种主体为包含利福喷丁的聚乳酸微球，同时结合了间充质干细胞和羟基磷灰石/磷酸三钙，组成三维复合支架，可治疗感染，促进骨形成。

2.3.2 阿仑膦酸盐 阿仑膦酸盐已证明口服可有效治疗和预防绝经后的骨质疏松症、皮质类固醇诱发的骨质疏松症和佩吉特骨病，其主要作用机制为抑制破骨细胞的骨吸收行为。到目前为止，它已成为治疗骨质疏松症和其他由于骨吸收引起的疾病的主要药物之一。Wang等[38]开发了一种具有短期控释特性的聚乳酸交联阿仑膦酸钠微球，可以连续9 d释放50～100 nm的阿仑膦酸钠。Yang[39]通过一种简便的方法制备了负载阿仑膦酸盐的羟基磷灰石微球，将骨髓间充质干细胞与微球共培养，不仅促进了骨髓间充质干细胞的增殖，而且还成功诱导了其成骨分化。这些均表明了这种微球结构能更好地促进阿仑膦酸盐的合理释放并发挥其成骨功能。

2.3.3 雷洛昔芬 绝经后的妇女由于缺乏雌激素，常常导致骨质疏松的发生。雷洛昔芬(raloxifene，RLX)是一种选择性雌激素受体调节剂，对于预防和治疗绝经后妇女的骨质疏松症具有良好的作用[40]。Zhang等[41]通过将负载RLX的PLGA微球接枝到由壳聚糖、胶原和β磷酸三钙组成的三组分支架，实现了RLX的可控性缓释。

2.4 微球与生物活性因子的结合应用 BMP-2是转化生长因子-β超家族的成员，具有促进体内成骨分化和软骨分化的重要作用，已被广泛地应用于骨缺损、骨不连和骨质疏松症等的修复治疗中[42]。Gong等[43]制备了BMP-2特异结合位点的CaCO3微球，并进一步将其包裹在纤维蛋白胶水凝胶中，实现了BMP-2持续高达21 d可控释放，有利于长期的成骨过程。Ji等[44]将载有BMP-2或P24的PLGA微球与壳聚糖、纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合，可以很好地缓释成骨因子来促进成骨，为自体和异体骨移植提供了更多的可能性。

综上所述，微球具有体积微小、高孔隙率和高载药率的特点，并具有可观的生物相容性、可降解性和缓释性能，近年来被广泛应用于骨损伤的治疗方面。然而，微球复杂的制备过程，不均匀的大小形态，不稳定的结构，以及无法精确控制药物释放和自身代谢时间用以配合骨骼修复过程等一系列问题，仍然需要进一步的深入研究。总体来看，微球作为治疗骨损伤的一种材料结构，在之后的临床治疗方面具有很大的应用潜力。