液体活检技术及其在乳腺癌中应用的研究进展▲

韦 苇 易贤林 廖 海

[1 广西医科大学附属肿瘤医院医学影像中心/广西临床重点专科(医学影像科)/优势培育学科(医学影像学科)，南宁市 530021，电子邮箱：570944612@qq.com； 2 广西医科大学附属武鸣医院泌尿外科，南宁市 530199]

【提要】 早期诊断、早期治疗是改善乳腺癌患者预后的关键。目前用于筛查和诊断乳腺癌的方法均存在一定的局限性，其中组织活检只能在诊断穿刺或肿瘤切除时进行，不能反映整个肿瘤复杂的分子表达谱。而液体活检可以在不同时间点多次进行，可以通过原发性和转移性肿瘤部位采样来确定肿瘤成分及肿瘤起源，模仿肿瘤个体的结构组合，可用于肿瘤遗传分析，这有助于乳腺癌的早期诊断、预后评估、个体化治疗。本文就液体活检技术及其在乳腺癌中应用的研究进展进行综述。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤[1]。近年来，我国乳腺癌的发病率及检出率逐年上升[2]，严重影响女性的生活质量和身心健康。早期诊断、早期治疗是降低乳腺癌死亡率、提高患者生活质量的关键。乳腺X线钼靶或超声是目前筛查乳腺癌的常用手段，但这些检查均存在一定假阴性和假阳性率[3]；乳腺癌组织病理检查是诊断乳腺癌的金标准，但其只能在诊断穿刺或肿瘤切除时进行，不能反映整个肿瘤分子复杂的表达谱。因此，需要一种更有效的新方法来诊断乳腺癌。

随着分子病理学、蛋白质组学及基因组学的深入研究，循环肿瘤标志物备受关注。循环肿瘤标志物包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、循环肿瘤RNA(circulating tumor RNA，ctRNA)及肿瘤细胞来源的外泌体等，而目前临床上采用液体活检的方法从患者的血液、胸腹腔积液、尿液等标本中检测这些标志物[3]，以达到诊断疾病的目的。上述循环肿瘤标志物在乳腺癌的早期诊断、进展与转移、异质性与耐药性以及预后疗效评估等方面都发挥着重要的协助作用，因此乳腺癌的液体活检已成为研究热点之一。本文就液体活检技术及其在乳腺癌中应用的研究进展进行综述，旨在为乳腺癌的分子诊断及临床疗效监测等提供新信息。

1 液体活检技术及其检测的主要循环肿瘤标志物

1.1 液体活检技术概述 在原发性肿瘤形成和生长、凋亡及坏死过程中，其各种组分如CTC、ctDNA、ctRNA和外泌体等，可释放到人体外周体液中[4]。液体活检通过检测人体体液的各种组分从而获取相关疾病的分子信息数据，具有可连续取样、自动化完成及结果可重复等诸多优点[5]。目前，常用的液体活检技术包括酶联免疫吸附检测、聚合酶链反应、生物传感器技术、高通量测序等。酶联免疫吸附检测、聚合酶链反应可检测蛋白、DNA/RNA的表达水平；生物传感器技术具有超灵敏、免标记的特点；高通量测序多用于基因组、表观基因组、转录组等检测；高通量纳米生物芯片集成系统可快速、同时和多重检测单个细胞囊泡的蛋白质、mRNA/微小RNA(microRNA,miRNA)及其组合[6]。上述检测技术均可通过检测患者体液(如尿液、血液、脑脊液及胸腹水等)，观察病症(如恶性肿瘤等)相关特异性蛋白、DNA、RNA等生物标志物的表达变化，从而诊断或辅助诊断疾病及评价临床治疗效果。

1.2 液体活检技术检测的主要循环肿瘤标志物

1.2.1 CTC：CTC是从原发性或转移性肿瘤中脱落的肿瘤细胞，通过淋巴系统或血管进入血液循环，这些细胞可以在肿瘤形成和生长期间、微转移期间等任何时间释放，甚至可以从肿瘤前病变中释放[7]。在肿瘤转移的早期阶段，肿瘤细胞可发生侵袭、脱落从而进入外周血液循环，并与原发性肿瘤具有相似的遗传或免疫学特征[8]。但由于机械因素或人体免疫系统的破坏，只有极少部分CTC能存活并进入血液循环系统，同时大多数CTC处于休眠状态或增殖能力低下，对化疗药物耐药，并可逃避机体的免疫监视[7]。目前认为CTC逃避细胞凋亡和免疫监视、抗脱落凋亡的能力可能与上皮-间充质转化相关[8]，但CTC的具体生存机制尚不明确。有研究显示，CTC特异性存在于肿瘤患者体内，1 g癌组织每天大约向外周血释放1×106个CTC，即使切除原发性肿瘤，在肿瘤衍生的炎性趋化因子的诱导下，CTC可通过基质金属蛋白酶1、肌成束蛋白1等载体从外周血渗透进入组织，返回原发性肿瘤的发生部位进行克隆性增殖，因此切除原发性肿瘤后外周血中仍能检测到CTC[8]。CTC可应用于预测癌症转移的风险，研究显示，CTC含量越高，转移的可能性越大[9]；检测CTC中的相关基因，可为靶向药物的选择提供指导[10]；CTC还可用于预测患者对治疗的反应及预后评估等[11]。

1.2.2 ctDNA：外周血游离DNA和外泌体是两个重要的液体活检生物标志物[12]。1977年，Leon等[13]发现癌症患者的循环游离DNA(circulating free DNA,cfDNA)含量显著高于正常健康人，故猜测其与癌症的发生相关 。因为cfDNA在血液中的浓度较高，其作为液体活检标志物的效果优于CTC[14]。在肿瘤患者中，ctDNA是总cfDNA的一个亚群。ctDNA仅占血浆总cfDNA的一小部分[15]。ctDNA可用于监测正在发生的肿瘤学改变，其表达水平可反映肿瘤突变、表观遗传变化和微卫星不稳定性等基因组学变化[16]。可通过靶向和非靶向测序技术分析从血液样品中提取的ctDNA序列，其中靶向测序可用于分析已知的乳腺癌相关基因组，而非靶向全基因组测序可用于识别未知的新变异。

1.2.3 ctRNA：高代谢率是肿瘤细胞的一个关键特征，这需要特定基因的高表达从而导致大量mRNA的产生，而这些mRNA又可能从细胞中大量流失。原发性肿瘤细胞坏死后可将核酸释放入血，在血液循环中凋亡或被人体免疫系统消灭的肿瘤细胞亦可将核酸释放入血，其中包含了ctRNA。目前，针对ctRNA的研究热点是循环非编码RNA，循环非编码RNA包括长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)、环状RNA、小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)和核仁小分子RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)、miRNA以及与Piwi蛋白相互作用RNA(piRNA)[8]。

在人类基因组计划中，只有约2%的人类基因组编码蛋白质被发现，而98%的转录产物是非编码RNA。lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，其可通过基因沉默、染色质修饰、转录激活等机制，在多个不同层面调控基因表达，从而调控癌症的发生和发展并影响癌症预后。根据其功能所涉及的不同分子机制，lncRNA可分为信号原型、诱饵原型、引导原型、支架原型等类型。近年来的研究表明，lncRNA、miRNA和mRNA三者之间可相互作用，lncRNA通过内源性竞争性抑制miRNA的表达，促进下游靶基因的表达，从而发挥促肿瘤或抑肿瘤的作用[7]。

1.2.4 外泌体：外泌体是细胞之间沟通的载体，直径在30～200 nm之间，是细胞分泌的包裹着DNA、RNA和蛋白质的囊泡，具有典型的脂质双分子层膜结构，在细胞培养上清液及血清、唾液、尿液等体液中均可存在；肿瘤细胞分泌的外泌体具有抑制免疫系统、刺激细胞生长、促进肿瘤血管生成等功能，同时还参与了肿瘤细胞的转移过程[8]。外泌体含有特定的标志蛋白及大量的脂质，后者包括胆固醇、磷脂酰丝氨酸和饱和脂肪酸等[17]，分析外泌体脂质表面分子抗原还可以确定肿瘤细胞的来源。除了蛋白质和脂质，外泌体还含有ctDNA、肿瘤mRNA和miRNA等成分，均在肿瘤生长、转移及细胞间通讯中发挥着重要作用[18]。

2 液体活检在乳腺癌中的临床应用

临床上，液体活检可以分析原发性和转移性乳腺癌患者相关标本中的生物标志物，可用于早期诊断或复发的检测。此外，液体活检可获得整个肿瘤基因组信息，可用于鉴定新的遗传标记，并用于患者个体化基因组分层和定制药物[3]。

2.1 用于乳腺癌的早期诊断 早期诊断对于降低乳腺癌死亡率至关重要；早期乳腺癌通常可以治愈，如果肿瘤<2 cm，早期诊断能明显提高患者的总体生存率和预后[19]。此外，乳腺癌的早期诊断可影响治疗方案的选择，而这与患者预后息息相关。然而，由于乳腺癌无特异性症状，早期诊断困难较大。多项研究表明液体活检在有助于在早期发现乳腺癌。其中，利用液体活检检测外周血ctDNA/cfDNA的水平，可比临床和放射学手段提前5个月诊断乳腺癌[20]。此外，在肿瘤的早期阶段，可通过检测体细胞中ctDNA的突变情况及血浆中的cfDNA水平提高早期诊断的准确度[21]。还有研究显示，对于具有乳腺癌易感基因突变的人群或乳腺癌的高风险人群，采用液体活检方法可以在更早期进行诊断[22]。故为了早期乳腺癌检测，需要开发高灵敏度检测血浆cfDNA水平的方法。虽然乳腺癌患者cfDNA中确切的肿瘤突变谱尚不清楚，但是研究者们已经开始通过筛选大量已知的乳腺癌始动基因、鉴定非肿瘤细胞的体细胞致癌突变以增加检测敏感性。

CTC的检测也有助于早期诊断乳腺癌。Kruspe等[23]开发了一种快速、灵敏的荧光核酸酶激活的探针来检测乳腺癌CTC，该方法的原理是对CTC衍生的核酸酶进行信号扩增，这些酶在包括上皮细胞-间充质转化诱导的乳腺癌在内的多种恶性肿瘤中升高；结果显示，荧光核酸酶激活的探针可用于快速检查CTC水平，可作为一种经济有效的乳腺癌早期诊断方法。但CTC应用于乳腺癌的诊断及预测尚处于早期研究阶段，其作用仍有待进一步研究验证。

2.2 用于乳腺癌的复发和预后评估 由于CTC会进入二级器官或被从血液中清除，其在外周血中的半衰期非常短(1～2.4 h)[10]。虽然在血液中分离低丰度CTC具有挑战性，但它们已被证明是预测肿瘤预后的有力工具。Bidard等[11]检测了乳腺癌患者血液中CTC的丰度，发现乳腺癌患者平均每7.5 mL血液中有5个或更多的CTC，同时也发现CTC低水平(低于5个/7.5 mL)患者的疾病无进展生存时间和总生存时间较CTC高水平患者更长。Madic等[24]探讨了三阴性乳腺癌患者的预后与血浆CTC水平的关系，也发现CTC计数与患者预后呈负相关，即CTC计数高的患者其总生存期及疾病进展时间更短。因此，CTC可作为潜在的液体活检标志物，为监测患者病情变化提供实时信息，有助于对乳腺癌患者预后进行评估。

ctDNA也可用于乳腺癌患者术后复发的评估[25]。基因组改变(包括多种ESR1基因组改变)有助于评估复发或转移性乳腺癌，基于ctDNA的基因组分析是一种敏感的检测手段[26]。研究表明，ctDNA水平与乳腺癌患者的总体存活率升高相关，并可定量评估早期的治疗反应；对ctDNA基因组畸变的测定也可用于辅助预测乳腺癌复发[3]。Garcia-Murillas等[25]跟踪检测ctDNA以监测早期乳腺癌患者根治性手术治疗后的复发情况，发现多数(96%)未复发患者术后ctDNA为阴性，ctDNA预测复发的准确率为80%(12/15)。另外一项回顾性研究结果显示，针对转移性乳腺癌，术后ctDNA水平诊断复发情况的准确率达到93%～100%[27]。此外，ctDNA可在出现临床症状前7.9～11.0个月预测乳腺癌患者的复发情况[25]。

2.3 用于肿瘤间/肿瘤内异质性的判断 干性突变发生于肿瘤的早期阶段并存在于所有的肿瘤细胞中；相反，在后期转移性肿瘤阶段发生的个体突变仅发现于部分肿瘤克隆中[28]。纵向监测和比例分析干性突变有助于肿瘤克隆分层，以及区分原发肿瘤部位和转移性肿瘤[28]。乳腺癌的组织活检只能在诊断穿刺或肿瘤切除时进行，不能反映整个肿瘤复杂的分子表达谱。而液体活检可以通过提供个体化的肿瘤图谱来实现这些功能，即通过判断肿瘤间的异质性，从而进行原发肿瘤定位。其中，组织特异性甲基化和核小体定位模式可以为原发性肿瘤的定位提供有价值的信息。Lehmann-Werman等[29]使用甲基化组数据库鉴定组织的特异性cfDNA，其利用硫酸氢盐来处理提取的cfDNA，对其含有特征CpG位点的区域进行PCR扩增，并对扩增的cfDNA进行了测序，以确定甲基化模式，然后与甲基化组数据库进行比对，从而确定从血液中提取的cfDNA的起源组织。

此外，ctDNA突变检测可用于判断肿瘤内的异质性。De Mattos-Arruda等[30]纳入了发生骨和肝脏转移的浸润性乳腺癌患者，在其接受蛋白激酶B抑制剂进行四线治疗期间，多次收集血浆来源的ctDNA用于测定肿瘤相关基因，结果表明，基于ctDNA的大规模并行测序是靶向治疗期间识别新发基因突变和监测体细胞遗传变异的潜在方法，这或有助于应对肿瘤内异质性所带来的挑战。

2.4 用于乳腺癌治疗反应的评估 在治疗过程中，肿瘤组织不断获得克隆和亚克隆的耐药细胞，而液体活检可在药物治疗期间纵向监测肿瘤细胞的动态克隆进化[31]。有研究显示，在治疗过程中可出现雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)基因突变，这可导致转移性乳腺癌细胞对内分泌治疗产生耐药性。例如，Beije等[32]纳入43例初次接受一线内分泌治疗的转移性乳腺癌患者和40例一线内分泌治疗后进展的转移性乳腺癌患者，检测了CTC和cfDNA中ESR1的突变情况，结果显示，与前者相比，后者cfDNA中ESR1突变发生率升高，提示ESR1突变可导致转移性乳腺癌患者对内分泌治疗产生耐药性。此外，O′Leary等[33]发现，在早期乳腺癌患者中，周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)4/6抑制剂治疗前后ctDNA中磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α突变的变化情况可较好地预测患者对CDK4/6抑制剂的反应性。由此可见，液体活检循环肿瘤标志物中相关基因的突变情况，有助于评估或预测乳腺癌患者的治疗效果。

2.5 用于乳腺癌微小残余病灶的评估 转移性肿瘤发生的决定性因素是治愈性手术和化疗后存在乳腺癌微小残余病灶(minimal residual disease，MRD)。早期检测MRD可以最大限度地提高患者的治疗效果。从MRD释放至血液的ctDNA中肿瘤相关基因发生了特异性突变，即ctDNA中存在不同于原发瘤灶的新转移瘤基因图谱表达[34]。而这些特异性突变可利用液体活检来鉴定。研究表明，对于已进行肿瘤切除术的乳腺癌患者，检测ctDNA和cfDNA有助于这些患者的术后监测，即寻找MRD，指导临床切除术后可能导致复发的任何残余肿瘤的治疗[35]。有学者使用微滴式数字聚合酶链式反应检测早期乳腺癌患者手术前后的血浆ctDNA中PIK3CA基因的突变情况，结果显示，14例术前cfDNA发现PIK3CA基因突变的患者中，有10例患者进行术后cfDNA检测，其中5例在术后仍可检测到PIK3CA突变[36]。这提示，在早期乳腺癌患者手术前后使用液体活检技术检测cfDNA有助于评估术后残余肿瘤的情况，这助于临床医师制订个性化治疗方案进行及时干预，避免过度治疗。

3 小 结

尽管目前液体活检还只能作为乳腺癌的二线诊断手段，但随着高灵敏度检测技术的进步，液体活检可为乳腺癌传统组织活检提供强有力的辅助作用。随着新的研究不断开展和标准化流程的建立，液体活检的特异性和灵敏度不断提高，液体活检将为乳腺癌的筛查和治疗提供更有力的支撑，在临床上发挥更重要的作用。