气相色谱法同时测定小麦胚片中26种有机磷农药残留

李婷婷，王 蓉，任兴权，刘 盼，陈 昆，霍文清，曾文锦

（酒泉市食品检验检测中心，甘肃酒泉 735000）

随着现代农业的发展和人类对粮食增产需求的增长，农药被广泛应用于粮食的种植生产过程，其中有机磷农药具有高效、易生物降解、广谱性高等特点，使用频率较高。但因大量使用而产生的负面效应也日益突显，当其在植物的可食用部分富集并通过食物链进入人体后，对人体健康产生的潜在危害主要表现在细胞毒性、遗传毒性和致癌性等方面[1]。因此，植物源性食品中有机磷农药的残留问题在食品安全监管领域内得到较多关注[2]，其中，氧乐果、三唑磷、毒死蜱等高毒禁限用有机磷农药是关注的重点之一[3]。有机磷农药的仪器分析方法主要有气相色谱法[4-5]、液相色谱法[6]、气相色谱-质谱联用法[7-8]和液相色谱-质谱联用法[9]。气相色谱法具有选择性好、灵敏度高、应用范围广、仪器运行成本相对较低等特点，广泛应用于食品中有机磷农药残留量的检测[10]；液相色谱法在强极性及热不稳定性农药的检测方面有较为突出的表现[6]。较色谱法而言，色谱-质谱联用法可实现多种性质相近且分离困难的农药残留物的定性鉴定和定量分析，但仪器价格昂贵，运行成本较高且对操作人员的专业素质要求较高。同时，为最大限度保留待测物质并消除杂质和基体对测定的干扰，样品前处理技术也在不断优化，常用的有固相萃取技术[11]、加速溶剂萃取技术[12]、凝胶色谱渗透技术[13]和QuEChERS技术[14-15]等。在本文中选择QuEChERS技术作为样品前处理方法，在节约试剂、提高前处理效率等方面有较为显著的优势。

在GB 2763-2021《食品安全国家标准食品中最大残留限量》[16]中，规定了小麦中氧乐果等26种有机磷农药的残留限量和二溴磷等8种有机磷农药的临时残留限量，其中，二嗪磷、庚烯磷和特丁硫磷的临时限量均为0.01 mg/kg，其余农药的最大残留限量均在0.02 mg/kg以上，故而在检测时所用方法的定量限应小于其最大残留限量值。小麦胚片是面粉加工工业的副产品之一，因富含人体必需的8种氨基酸、优质的植物脂肪酸、维生素及矿物元素等营养物质而受到人们的喜爱[17-18]。近年来，随着小麦胚营养成分和功能性成分研究的深入，小麦胚的新产品开发及精深加工在食品行业亦得到较多关注[19-20]。目前，小麦胚及以其为主要原料的食品中农药残留现状的研究在国内报道较少。小麦胚及其深加工产品基体组成复杂，基质效应给其中有机磷农药残留的检测带来一定难度。因此，开发小麦胚片中多种有机磷农药残留的检测方法和明确基质效应的影响对研究其农药残留现状有较为积极的意义。

本文研究了气相色谱同时测定小麦胚片中26种有机磷农药残留物的方法并探究了基质效应对测定结果的影响。采用乙腈-醋酸溶液提取小麦胚片样品中的待测物，通过QuEChERS技术净化样品提取溶液，利用DB-17型毛细管色谱柱和程序升温实现待测物的分离，采用火焰光度检测器进行检测，使用空白基质溶液配制的标准工作液作为标准系列溶液绘制标准曲线，以保留时间定性，以外标法定量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦胚片 酒泉市双禧面粉有限责任公司；农药标准溶液 浓度均为100 μg/mL，溶剂均为丙酮，天津农业部环境保护科研检测所；乙腈 色谱纯，德国Meker公司；丙酮 色谱纯，南京化学试剂股份有限公司；十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA） 40～60 μm，美国Agilent公司；石墨化碳黑（GCB） 40～120 μm，上海麦克林生化科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

7890B气相色谱仪（配有火焰光度检测器）、DB-17型毛细管色谱柱30 m×0.32 mm×0.25 μm 美国Agilent公司；PL602E/02电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TG16离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；MV5高通量平行浓缩仪 北京莱伯泰科仪器股份有限公司；涡旋混合器 德国IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 柱温箱升温程序的优化 配制26种目标农药浓度为0.5 μg/mL的混合标准溶液，通过不断改变升温速率和保持时间，优化柱温箱升温程序，以确保所有的待测目标物得到有效分离。再配制浓度为0.50 μg/mL的单一农药标准溶液依次进样，逐一确定每种目标农药的保留时间。

1.2.2 样品前处理方法 将样品粉碎后，过筛混匀，于-18 ℃冰箱中密封保存。参照GB 23200.116-2019《食品安全国家标准 植物源性食品中90种有机磷类农药及其代谢物残留量的测定》[21]中的前处理方法，加入无水硫酸镁进一步去除样品提取溶液中的水分，得到第一种样品前处理方式，即未采取净化措施的前处理方法。参照GB 23200.113-2018《食品安全国家标准 植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定》[22]中的QuEChERS净化技术，并加入石墨化炭黑（GCB）去除样品提取液中的色素，得到第二种前处理方式，即采取净化措施的前处理方式。

第一种：准确称取5.00 g样品于50 mL离心管中，加入10.0 mL水浸润30 min，加入15.0 mL乙腈，2000 r/min涡旋震荡5 min，加入1颗陶瓷均质子后再加入3 g氯化钠和1 g无水硫酸镁，剧烈震荡1 min，4000 r/min离心5 min。准确吸取上层乙腈相3.0 mL于试管中，40 ℃下加氮气缓缓吹至近干，准确加入1.0 mL丙酮复溶，过0.22 μm有机滤膜，上机分析。

第二种：准确称取5.00 g样品于50 mL离心管中，加入10.0 mL水浸润30 min，加入15.0 mL乙腈-醋酸溶液（体积比为99:1），2000 r/min涡旋震荡5 min，加入1颗陶瓷均质子后再加入1.5 g乙酸钠和3 g无水硫酸镁，剧烈震荡1 min，4000 r/min离心5 min。准确吸取上层有机相6.0 mL于15 mL离心管中，并向其中加入360 mg PSA、360 mg C18和100 mg GCB，2000 r/min涡旋震荡1 min，4000 r/min离心5 min，取3.0 mL净化液于试管中，40 ℃下加氮气缓缓吹至近干，准确加入1.0 mL丙酮复溶，过0.22 μm有机滤膜，上机分析。

1.2.3 标准溶液配制 未净化的空白基质溶液：空白小麦胚片样品经1.2.2中第一种前处理方法得到的样品溶液，于4 ℃冰箱保存。

净化后的空白基质溶液：空白小麦胚样品经1.2.2中第二种前处理方法得到的样品溶液，于4 ℃冰箱保存。

混合标准储备液：分别取敌敌畏、灭线磷、硫线磷等26种有机磷农药标准溶液0.20 mL于10 mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，得到浓度为2.0 μg/mL的混合标准溶液，于-18 ℃冰箱中避光保存。

标准工作液：分别吸取0.025、0.125、0.25、1.25、2.50 mL混合标准储备液于5 mL容量瓶中，用丙酮定容，配制成质量浓度分别为0.010、0.050、0.10、0.50、1.0 μg/mL的混标系列工作液（试剂标液），临用现配。

基质标准工作液：吸取0.025、0.25和2.50 mL混合标准储备液于5 mL容量瓶中，分别用未净化的空白基质溶液和净化后的空白基质溶液定容，配制成质量浓度分别为0.010、0.10和1.0 μg/mL的未净化的基质标准工作液和净化后的基质标准工作液（基质标液），临用现配。

1.2.4 基质效应试验 在基质效应试验开始前，先用未净化的空白基质溶液连续进样5次以饱和衬管上的活性位点，待出峰高度正常后依次进样标准工作液、未净化的基质标准工作液和净化后的基质标准工作液。在最优的色谱条件下进行测试，记录每种目标物的峰面积，采用峰面积的相对比值来评价基质效应（Matrix Effect，ME）。

式中：ME未净化：配制基质标液的溶剂为未净化的空白基质溶液；ME净化：配制基质标液的溶剂为净化后的空白基质溶液。一般认为：当ME大于100%，为基质增强效应；当ME小于100%，为基质减弱效应；当ME位于80%～120%的范围内，为弱基质效应，即基质效应不显著；当ME位于70%～80%或120%～130%的范围内，为较强基质效应，即基质效应显著；当ME大于130%或小于70%时，为强基质效应，即基质效应非常显著[23]。

1.2.5 加标回收试验 选取空白小麦胚片作为测试样品，分别进行0.02、0.10和0.50 mg/kg三个含量水平的加标回收试验。样品和加标样品中目标物的含量均通过下式计算：

式中：X：待测物含量，mg/kg；C：样品测试溶液中待测物浓度，μg/mL；V1：提取溶剂体积，mL，V1=15.0 mL；V2：用于氮吹的净化液体积，mL，V2=3.0 mL；V3：样品测试溶液定容体积，mL，V3=1.0 mL；m：称样质量，g；f：稀释倍数；1000：单位换算系数。

重复性限通过如下公式[24]计算：

式中：r：重复性限；Sr：重复性标准偏差。

1.2.6 色谱条件 色谱柱：DB-17（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；进样口温度：230 ℃；进样方式：不分流进样；进样体积：1.0 μL；柱流量：1.5 mL/min；检测器温度：260 ℃；空气流量为100 mL/min，氢气流量为75 mL/min，尾吹气流量为60 mL/min；柱温箱升温程序见表1。

表 1 柱温箱升温程序Table 1 The temperature-rising program of column oven

1.3 数据处理

使用Microsoft excel 2010软件对实验数据进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 柱温箱升温程序的选择

由于气相色谱法对有机磷农药的定性主要依赖于保留时间，有效分离待测物中性质相似、沸点相近的物质是准确定量的关键因素之一。设置三个程序升温梯度，并依次优化3个梯度的升温速率和改变保持时间，优化得到的柱温箱升温程序在表1中给出，标准物质的气相色谱图如图1。较NY/T 761-2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》[25]中给出升温程序而言，可在不分组测试的前提下实现26种有机磷农药的有效分离。在实际样品测定时，目标物组分的保留时间与标准品的保留时间相差在±0.05 min之内，可认定为该农药[20,25]。

图 1 标准物质的气相色谱图Fig.1 The gas chromatogram diagram of standard substances

2.2 前处理方法比较及基质效应评价

2.2.1 前处理方法比较 较NY/T 761-2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》[25]和GB 23200.116-2019《食品安全国家标准 植物源性食品中90种有机磷类农药及其代谢物残留量的测定》[20]两个在前处理过程中均未采取净化措施的标准方法而言，本实验所设计的前处理方法具有以下优势：a.将称样量分别从50.00[25]和10.00 g[20]减小至5.00 g，将提取溶剂乙腈的用量从50 mL降低至15 mL，较大程度节约了有机试剂的用量；b.在溶剂置换时，将水浴温度从80 ℃降低至40 ℃，使得热敏感性待测目标物得到最大程度的保留，同时将待净化溶液体积从10.0 mL变为3.0 mL，相应将复溶溶剂体积从5.0 mL降低为1.0 mL，使得待测物富集倍数从2倍增加至3倍；c.采用QuEChERS技术净化样品提取溶液，有望降低基质效应对测定结果的影响，同时为减少样品基体对衬管和色谱柱的污染做出较为积极的贡献。

较普通谷物而言，小麦胚产品中蛋白质和脂肪含量相对较高，且样品提取液为较深的黄色。本实验在GB 23200.113-2018《食品安全国家标准 植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定》中给出的谷物样品QuEChERS净化方法的基础上，将每毫升净化液所需PSA和C18的用量增加为原来的1.2倍，同时向6.0 mL待净化提取液中加入100 mg GCB去除色素对测定结果的干扰。分别使用浓度为0.05和0.5 μg/mL的未净化基质标准工作液代替样品提取溶液经净化步骤和溶剂置换步骤后进行测定，在0.05 μg/mL的浓度水平下，26种目标农药的回收率在93.80%～103.80%之间；在0.5 μg/mL的浓度水平下，26种目标农药的回收率在93.98%～106.02%之间，说明本实验改进的样品前处理方法适用于以小麦胚为主要原料的食品。因此，选取1.2.2中第二种前处理方法作为本实验的前处理方法。

2.2.2 基质效应评价 待测目标物均为有机磷农药，因含有P=O或P=S基团而易被进样口活性位点吸附[26]，其中氧乐果、马拉硫磷等多种待测物属于基质效应敏感的典型农药，且基质效应与基质类型之间存在密切联系[27-28]。除此之外，基质效应还与农药的极性有关。有研究表明，农药的极性越大，基质效应越明显[29]。因此，明确基质效应对测定结果的影响十分必要。选取待测目标物质量浓度均为0.010、0.10和1.0 μg/mL的试剂标准溶液、未净化的空白基质标准溶液和净化后的空白基质标准溶液考察基质效应在低、中、高三个质量浓度水平下对测定结果的影响，并计算基质效应ME值，结果见表2。a.本实验所涉及的26种有机磷农药的ME值均大于100%，表现出基质增强效应。b.在三个浓度水平下，治螟磷、特丁硫磷、二嗪磷、氯唑磷、毒死蜱和甲基异柳磷等6种有机磷农药的ME净化值和ME未净化值均在100.08%～119.76%之间，表现出的基质增强效应不显著。c.敌敌畏的ME净化值和ME未净化值均在119.63%～241.65%之间，相同浓度下的ME净化值均大于ME未净化值。d.灭线磷、硫线磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、杀扑磷、伏杀硫磷、亚胺硫磷、谷硫磷等9种有机磷农药在中、高浓度水平下的ME净化值位于100.87%～118.44%之间，表现出的基质增强效应较弱；在低浓度水平下，灭线磷表现出较强的基质增强效应，其余农药均表现出非常显著的基质增强效应。e.甲拌磷、甲基毒死蜱和倍硫磷在低、中浓度水平下的ME净化值均小于ME未净化值；在高浓度下的ME净化值在105.26%～106.77%之间，表现出较弱的基质增强效应。f.乐果仅在高浓度下的ME净化值位于120%～130%之间，表现为较强的基质增强效应；低、中浓度水平下的ME净化值和三个浓度水平下的ME未净化值均大于130%，表现出的基质增强效应非常显著。g.三唑磷在三个浓度水平下的ME未净化值和在低浓度水平下的ME净化值均大于130%，表现出的基质增强效应非常显著；在中、高两个浓度水平下的ME净化值分别为122.12%和128.11%，表现出较强的基质增强效应。h.氧乐果、水胺硫磷、丙溴磷、甲基硫环磷和硫环磷等5种有机磷农药在低、中、高三个浓度水平下的ME值均大于130%，表现出的基质增强效应非常显著。由此可见，当样品经过QuEChERS技术净化，在中、高浓度水平下降低基质效应的影响有较为明显的作用。对于QuEChERS技术净化后基质效应降低不明显的目标农药而言，在绘制标准曲线时采用净化后的空白基质溶液配制混合标准系列溶液，可进一步消除基质效应对测定结果的影响。图2比较了浓度为0.10 μg/mL的待测目标物在3种标准溶液中的峰面积。

图 2 基质效应对测定结果的影响Fig.2 The effect of matrix effects on determination results

表 2 目标物在不同浓度水平下的基质效应Table 2 The matrix effects of the target organophosphorus pesticides at different concentration levels

2.3 方法的分析特性

在最佳测试条件下，26种有机磷农药均在0.010～1.0 μg/mL的线性范围内与对应的峰面积呈线性关系，相关系数均大于0.9991。除马拉硫磷、甲基毒死蜱和谷硫磷外，其余目标农药的线性范围均包含了GB 2763-2021《食品安全国家标准食品中最大残留限量》[16]中相应有机磷农药的最大残留限量值对应的样品溶液浓度。当样品溶液浓度超出线性范围后，可进行稀释，使其位于线性范围之内，并将稀释倍数一并带入1.2.5中含量公式计算。以10倍的信噪比确定仪器定量限，并与称样量、提取溶剂体积及定容体积一起代入1.2.5中给出的含量公式，计算方法定量限。26种目标物的方法定量限均在0.005～0.010 mg/kg之间，低于NY/T 761-2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》中给出的方法检出限，且低于GB 23200.116-2019《食品安全国家标准植物源性食品中90种有机磷类农药及其代谢物残留量的测定》给出的方法定量限。表3给出了26种有机磷农药对应的保留时间、线性范围、线性回归方程、相关系数和方法定量限。

2.4 加标回收试验

为考察该方法的准确性和精密度，选取空白小麦胚片作为测试样品，进行3个不同水平的加标回收试验，每个加标水平平行测定5次，结果见表4。三个加标水平下，所有待测物的加标回收率均在80.61%～116.19%的范围内，相对标准偏差均在0.62%～6.83%之间，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》[30]的要求，说明该方法可应用于小麦胚片及以其为主要原料的深加工产品中26种有机磷农药的阳性筛查和定量测定。用1.2.5中给出的公式，计算每个加标水平下的重复性限，结果一并在表4中给出。从表4中重复性限数据可知，在0.10 mg/kg加标水平下，所有待测物的重复线性位于0.0047～0.0097之间，均小于GB 23200.116-2019《食品安全国家标准植物源性食品中90种有机磷类农药及其代谢物残留量的测定》[20]给出的相同浓度下的重复性限。

表 3 有机磷农药的保留时间、线性范围、线性方程、相关系数及方法定量限Table 3 Retention time, liner ranges, regression equations, correlation coefficients and limit of quantitation for the target organophosphorus pesticides

表 4 样品中26种有机磷类农药残留量的加标回收测定结果（n=5）Table 4 Results for recovery determination of the target organophosphorus pesticides in samples (n=5)

2.5 实际样品测定

随机选取10份小麦胚片产品作为实际样品，采用本实验所描述的方法进行检测，其中 2份样品中检出了本实验涉及的目标农药，其余8份样品中均未检出本实验涉及的目标农药。在2份阳性样品中，1份检出马拉硫磷，含量为0.074±0.005 mg/kg，一份检出甲基毒死蜱和杀螟硫磷，含量分别为0.062±0.004和0.043±0.002 mg/kg，均小于GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中最大残留限量》中规定的小麦胚产品中相关农药的最大残留限量。

3 结论

本实验建立了一种QuEChERS净化技术联用气相色谱法同时测定小麦胚片产品中多种有机磷农药残留量的方法，并采用低、中、高三个浓度水平的加标回收试验验证了方法的准确性和可靠性，得到较好结果。同时，评价了基质效应对测定结果的影响，结果表明所有的待测目标物均表现出不同程度的基质增强效应，其增强程度因农药的自身性质和浓度水平而异，同时与样品中基体含量的高低有一定关联。该方法前处理简便且操作简单、灵敏度好、准确度高，可满足以小麦胚为主要原料的食品中26种有机磷农药的同时测定，有望为小麦胚片及其深加工产品中有机磷农药残留的阳性初筛和定量检测提供帮助。