60Co-γ射线辐照对粉黛乱子草种子萌发及幼苗生长的影响

姜恒越, 高毓翎, 李媚晴, 陈志龙, 庄黎丽, 杨志民, 张夏香

(南京农业大学， 江苏 南京 210095)

辐射诱变育种是利用γ射线、β射线、X射线、中子、紫外线、激光等物理诱变源，诱发植物DNA变异和染色体畸变，引起植物形态结构和生理生化等多方面的变异，从而创制新种质的方法[1-4]。其中，γ射线因其穿透力好、成本低、突变率高、变异范围广等优势，被广泛应用于作物、园艺以及林木育种，已成为改良农业新品种的重要途径之一[5-7]。目前，辐射诱变育种工作面临的最主要问题是最佳辐照剂量的选择，不同的植物种类、同种植物的不同品种、同一植物的不同发育阶段及不同器官的最佳辐照剂量均存在显著差异，选择合适的辐射剂量是保证辐射诱变育种效率的重要前提[8-10]。

粉黛乱子草(Muhlenbergiacapillaris(Lam.) Trin.)，又名毛芒乱子草，为禾本科(Gramineae)乱子草属植物，是一种多年生暖季型观赏草，其圆锥花序庞大、繁密，花期长，粉紫色花穗如发丝从基部长出，远看如红色云雾，花群颜色美观、质地独特，目前被广泛应用于国内外园林景观，打造特色花境[11]。粉黛乱子草自然分布于美国中西部，生长于草地、荒原或开阔林地的沙砾土壤中，喜光、耐半阴、耐干旱、耐盐碱，且具有抗病性强、维护成本低的特性[12]。目前，国内外粉黛乱子草品种单一，针对粉黛乱子草的研究也主要集中于园林应用、鉴定评价以及养护管理技术等方面[13-17]，关于粉黛乱子草新品种选育进展甚缓，无法满足日益增加的粉黛乱子草市场需求。因此，探索60Co-γ射线辐射诱变对粉黛乱子草种子萌发及幼苗生长的影响，可为粉黛乱子草辐射诱变育种提供理论参考。本研究采用粉黛乱子草干种子为实验材料，设置5个不同辐射剂量处理，测定种子萌发及幼苗生长相关指标，为粉黛乱子草辐射诱变新种质创制提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

以粉黛乱子草‘粉黛’品种为材料，由北京市农林科学院草业花卉与景观生态研究所提供，种子于11月底收获后经自然风干、脱粒，选用纸信封盛装，储存备用。

1.2 实验设计与处理

1.2.160Co-γ射线辐照 利用南京航空航天大学辐照中心60Co-γ射线源，对挑选出的完整饱满的粉黛乱子草干种子(种子含水量约为10%)进行辐照处理，设置5个剂量梯度，分别为100,200,300,400和500 Gy，辐射剂量率为1.08 Gy·min-1，以未经辐照的种子为对照。

1.2.1发芽试验 选取各辐射剂量处理与对照处理过的粉黛乱子草种子各400粒，每个剂量4个重复，每个重复100粒种子，蒸馏水浸泡24 h后，用体积分数为75%的酒精消毒30 s，蒸馏水冲洗3次，再用质量分数为2%的次氯酸钠溶液消毒20 min，蒸馏水冲洗3次。将消毒后的种子置于铺有一层滤纸的培养皿中，在人工气候室中培养，胚芽长度达到种子长度一半时视为发芽。人工气候室环境条件设置为：昼夜温度为23℃/20℃，昼夜周期为14 h/10 h，相对湿度控制在70%，光照强度为300 μmol·m-2·s-1。每天固定时间采用称重法进行补水，计数种子发芽情况。于第10天计算种子发芽势，第21天萌发实验结束时计算种子的发芽率。于发芽试验最后一天，使用游标卡尺测量胚轴至胚芽尖端、胚轴至胚根尖端的长度，精确到0.01 cm，分别记作胚芽长、胚根长。计算方法如下：

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)，Gt指时间t的种子发芽数，Dt指相应的发芽试验天数。

1.2.2幼苗试验 发芽试验结束后，选取每个辐射剂量处理具有代表性的幼苗，采用96孔植物水培盒于人工气候室进行水培培养，昼夜温度为23℃/20℃，昼夜周期为14 h/10 h，相对湿度控制在70%，光照强度为650 μmol·m-2·s-1；先以1/8标准浓度的Hoagland植物水培营养液[18]缓苗一周后，采用1/4标准浓度的Hoagland植物水培营养液继续培养。每周使用游标卡尺测量幼苗的株高及根长。

植物水培盒培养三周后，转入周转箱继续进行六周的水培培养，采用1/2标准浓度的Hoagland植物水培营养液培养，人工气候室培养条件不变。每周测量植株株高、叶宽、分蘖数、总叶数、绿叶数及根长。

1.3 根系形态指标测定

水培培养最后一天(苗龄91天)时，将各辐射剂量处理与对照处理具有代表性的粉黛乱子草植株根系洗净后，用扫描仪(EPSON，12000XL，日本)扫描根系，使用WinRHIZO软件(V5.0，加拿大)进行根系形态指标分析，分析指标包括：总根长(cm)、根表面积(cm2)、根体积(cm3)及根平均直径(mm)。

1.4 数据处理与统计分析

为了综合评价不同辐射剂量对粉黛乱子草种子萌发及幼苗生长的影响，本研究运用隶属函数法对各处理下粉黛乱子草的形态指标进行综合分析，计算公式：y=(xa-xmin)/(xmax-xmin)，其中：xa代表某一指标在某处理下的值，xmax和xmin分别代表同一指标中在不同处理下的最大值与最小值。

采用SPSS 21.0软件对所测数据进行方差分析，对不同处理的数据选用单因素ANOVA分析处理，用Duncan法进行差异显著性检验(P< 0.05)；采用Sigmaplot(14.0，美国)作图。

2 结果与分析

2.1 不同60Co-γ辐照剂量对粉黛乱子草种子萌发的影响

随着60Co-γ射线辐射剂量的升高，各项发芽指标均呈现出先上升后下降的趋势(表1)。在200～400 Gy辐射剂量范围内，粉黛乱子草的发芽率及发芽指数均显著高于对照(P< 0.05)。当辐射剂量为400 Gy时，发芽率达到最大值(87.25%)；而500 Gy的辐照处理则显著降低了发芽率(68.75%)和发芽指数(7.72)。300 Gy及400 Gy的辐照处理显著提高了粉黛乱子草种子的发芽势(P< 0.05)，而当辐射剂量达到500 Gy时，发芽势为最小值(49.50%)。这表明适量的辐射处理(200～400 Gy)能促进粉黛乱子草种子萌发，但过高剂量的辐射处理(500 Gy)则显著抑制了种子萌发。

表1 不同60Co-γ辐照剂量对粉黛乱子草种子萌发的影响Table 1 Effects of different 60Co-γ radiation doses on seed germination of Muhlenbergia capillaris

随着辐射剂量的增加，粉黛乱子草的胚芽长度呈先升高后降低的趋势。当辐射剂量为100 Gy时，胚芽长度达最大值；在辐射剂量超过100 Gy后，随着辐射剂量的增加，粉黛乱子草胚芽长度逐渐降低，当辐射剂量达到400 Gy时，其胚芽长度均值约为对照组的1/2；当辐射剂量达到500 Gy时，其胚芽长度均值约为对照组的1/6。粉黛乱子草胚根长度则随辐射剂量增加呈逐渐降低的趋势，当辐射剂量为100 Gy时，胚根长度比对照减小了0.77 mm；当辐射剂量为500 Gy时，胚根长度受辐射的抑制作用较为明显，该辐射剂量下的胚根长度仅为对照组的1/3。以上结果表明，辐射处理显著抑制了粉黛乱子草胚根生长，而低辐射剂量能促进胚芽生长，高辐射剂量抑制胚芽生长。

2.2 不同60Co-γ辐照剂量对粉黛乱子草幼苗生长的影响

60Co-γ射线辐照处理对粉黛乱子草幼苗长势、株高、根长的影响图1所示。辐照剂量达到500 Gy时，粉黛乱子草成苗率低于2%，因此，幼苗形态指标测定仅包括0，100，200，300及400 Gy 5个处理。苗龄为28天时，100 Gy处理的粉黛乱子草株高及根长均为最大值；苗龄为35天及42天时，对照组的株高均高于各辐照处理下幼苗株高，且随着辐射剂量的增加，粉黛乱子草的株高及根长逐渐降低，辐射剂量为400 Gy时，株高及根长均为最低值。因此，较低的辐射剂量(100 Gy)对早期幼苗株高及根长有一定的促进作用，但过高的辐射会抑制株高和根长的增加。

图1 不同60Co-γ辐照剂量对粉黛乱子草幼苗株高和根长的影响Fig.1 Effects of different 60Co-γ radiation doses on plant height and root length of Muhlenbergia capillaris seedlings

2.3 不同60Co-γ辐照剂量对粉黛乱子草植株形态指标的影响

随着植物生长周期推移，粉黛乱子草植株株高、根长、叶宽、总叶数、绿叶数及分蘖数均呈现逐渐升高的趋势(图2)。与对照相比，各辐照处理均显著降低了粉黛乱子草植株的株高及叶宽，且随着辐射剂量的增加呈现逐渐降低的趋势，400 Gy达最低值。苗龄为91天时，与对照相比，100～400 Gy辐照处理下株高降低了19.03%～56.47%，根长降低了8.28%～37.96%，总叶数降低了18.41～26.49%，绿叶数降低了20.30%～28.82%，分蘖数减少了21.92%～43.64%。

图2 不同60Co-γ辐照剂量对粉黛乱子草植株形态的影响Fig.2 Effects of different60Co-γ radiation doses on morphology of Muhlenbergia capillaris plants

2.4 不同60Co-γ辐照剂量对粉黛乱子草根系形态指标的影响

粉黛乱子草总根长随辐射剂量增加呈先增加后减小的趋势(图3)，辐射剂量为100 Gy时根长达最大值，但与对照处理差异不显著；当辐射剂量达到200 Gy及以上时，随着辐射剂量的增加，粉黛乱子草总根长逐渐降低；当辐射剂量达到400 Gy时，粉黛乱子草总根长比对照降低了55.42%。根表面积、根体积受辐射剂量影响的变化趋势与总根长基本一致，辐射剂量为100 Gy时粉黛乱子草根表面积与根体积分别增加了22.08%与6.46%，而辐射剂量200～400 Gy下粉黛乱子草根表面积与根体积显著下降，当辐射剂量达到400 Gy时，根表面积与根体积分别仅为对照的29.34%及19.79%，表明辐射剂量达400 Gy对根体积及根表面积有极强的抑制作用。相对于总根长、根表面积及根体积，辐照对粉黛乱子草根平均直径的影响较小，仅当辐射剂量达到400 Gy时，粉黛乱子草根平均直径较对照显著降低(—34.94%)。

图3 不同60Co-γ辐照剂量对粉黛乱子草根系形态的影响Fig.3 Effects of different 60Co-γ radiation doses on root morphology of Muhlenbergia capillaris plants

2.5 隶属函数综合分析

为了综合评价不同60Co-γ辐射剂量对粉黛乱子草种子萌发及幼苗生长的影响，对不同处理下粉黛乱子草的种子萌发相关指标(发芽率、发芽势、发芽指数、胚芽长度、胚根长度)、植株形态指标(株高、根长、叶宽、总叶数、绿叶数、分蘖数)及根系形态指标(总根长、根表面积、根体积、根平均直径)进行了隶属函数分析，计算总得分，结果表明0 Gy>100 Gy>200 Gy>300 Gy>400 Gy，表明本研究的辐照处理(100～400 Gy)均不同程度地影响了粉黛乱子草植株的长势(表2)。

表2 不同60Co-γ辐照剂量对粉黛乱子草种子萌发及幼苗生长的隶属函数分析Table 2 Subordinate function analysis for the effects of different60Co-γ radiation doses on seed germination and seedling growth of Muhlenbergia capillaris

2.6 粉黛乱子草干种子60Co-γ辐照半致死剂量计算

统计不同剂量处理下粉黛乱子草的成苗率，利用线性回归方程式绘制标准曲线，可得标准曲线方程为y=0.16x+5.03，R2=0.87(图4)，计算求得：粉黛乱子草干种子受60Co-γ辐射的半致死剂量为274.03 Gy。

图4 60Co-γ辐射剂量与粉黛乱子草死亡率的线性回归分析Fig.4 Univariate linear regression between radiation dose and death rate of Muhlenbergia capillaris

3 讨论

诱变剂量的选择对于诱变育种至关重要，辐射剂量过高则存活率降低，失去选择机会，而剂量过低则诱变效果不佳，获得突变体的概率大大减少[19-20]。本研究对粉黛乱子草60Co-γ射线的辐射敏感性分析发现，不同辐射剂量对粉黛乱子草种子萌发及幼苗生长的影响各异。经不同剂量60Co-γ射线辐射处理后，粉黛乱子草种子的萌发率、发芽势、发芽指数均在一定程度上呈现先升高后降低的变化趋势。在辐射剂量300～400 Gy之间，萌发指标可以达到峰值，当辐射剂量达到500 Gy时，各项发芽指标急剧下降。在一定范围内的低剂量辐照可以提高粉黛乱子草种子萌发的相关指标，但超过了一定的辐射剂量则会对种胚造成伤害，显著抑制种子萌发。彭梦婕等[21]针对60Co-γ射线对紫薇种子萌发、幼苗生长的研究中，也发现了低剂量的辐照处理(100 Gy)对种子的发芽率、发芽势和发芽指数均有一定的促进作用，而较高剂量的辐照(180 Gy)则会显著影响种子的成苗率。低剂量辐照可能通过提高种子的新陈代谢水平，促进种子的萌发，而高剂量辐射则可能破坏细胞膜结构、激发自由基积累、改变种子内多种生理生化作用，影响种子活力[8,22]。

植株形态指标是评价粉黛乱子草等观赏草的重要评价标准，植株的株高、叶宽、叶片数量、分蘖数等指标都具有评价价值。本研究发现，60Co-γ射线辐照虽然促进了种子萌发进程，但随着幼苗生长发育，辐照处理均不同程度地影响了植株各形态指标，降低了株高、根长、叶宽、总叶数、绿叶数及分蘖数，其中100 Gy影响较小。刘淑霞等[23]在对紫花苜蓿的研究中也发现，随着60Co-γ辐射剂量的增加，紫花苜蓿的发芽率、出苗率、株高、株干质量、株鲜质量及叶绿素含量均显著下降。唐昌亮等[24]在对洋紫荆的研究中发现当60Co-γ辐照超过一定范围时，植株幼苗生长的大多数指标都会出现显著抑制，但一定程度上提升突变率，有利于后续对突变体的进一步筛选。

根系是植物吸收水分及养分的主要器官，其形态结构(根长、表面积、体积等)直接影响植物生长发育、生物产量及植物应对环境变化的能力[25-26]。李春牛等[22]发现，辐照处理显著影响了茉莉花种子生根，随着辐照剂量的增加，种子的生根率及根长均呈下降趋势，不同处理间差异极显著(P<0.01)。袁帅等[8]发现50 Gy处理下扁穗雀麦幼苗根长略高于对照(P>0.05)，而辐射剂量超过100 Gy后，根系长度显著下降；根系表面积和体积的变化均与辐射剂量的变化呈反比，根系平均直径在60Co-γ辐射处理下与对照间无明显差异。本研究中，100 Gy处理下粉黛乱子草总根长、根表面积略高于对照，但差异不显著；辐照剂量超过100 Gy后，总根长、根表面积、根体积显著下降；除400 Gy外，其余各处理均未显著影响根平均直径，这与前人的研究基本一致，表明根平均直径受辐照影响较小，辐照对根系形态的影响主要集中于根长、根体积与根表面积。

4 结论

低剂量的60Co-γ射线辐照对粉黛乱子草种子萌发具有一定的促进作用，提高了种子的发芽率及发芽势；但随着粉黛乱子草生长发育进程推进，植株大部分生长指标均受辐照影响，呈现了逐渐下降的趋势。在根系形态指标方面，100 Gy辐照促进了根表面积和根体积的增加，200～400 Gy则显著抑制了总根长、根表面积及根体积。通过致死率-辐射剂量回归方程计算得出，粉黛乱子草干种子受60Co-γ辐射的半致死剂量为274.03 Gy。该研究结果可望为粉黛乱子草辐射诱变及粉黛乱子草新种质创制提供一定的数据支撑和理论参考。