万寿菊不同部位提取物制备及其对柑橘根线虫的毒杀影响

郭雁君，吉前华*，蒋惠，郭丽英，杨凤梅，胡益波，

（1.广东省肇庆学院果树研究所 肇庆市 526061；2.广东省德庆县柑桔研究所 德庆县 526600）

我国是世界柑橘生产第一大国，西江流域柑橘产业带是我国柑橘生产的重要区域，其中砂糖橘Citrus reticulate（Blanco cv.Shatangju）是其主栽品种之一，也是我国特有的地方品种，目前广西是我国砂糖橘种植面积最大的产区。柑橘根线虫病在我国柑橘主产区都有发生，其中尤以柑橘半穿刺线虫Tylenchulus semipenetrans和柑橘根结线虫MeloidogyneSPP.危害最大[1-2]，成为近年来制约砂糖橘产业健康发展的一个常见虫害。砂糖橘感染柑橘根线虫后，柑橘植株生长减缓，叶片黄化，叶片翻卷，树冠衰退，花和果实易脱落，产量下降，严重的可以导致植株多年不结果或死亡。其主要原因是根线虫侵染根系和取食，造成机械损伤，引发病原菌侵染和影响柑橘根和叶中渗透活性离子的分配[3]，导致根的吸收能力衰退，影响根系的正常生理功能，植株对土壤养分的吸收能力减弱，从而影响其生长发育。柑橘根线虫1 a发生10个世代以上，对柑橘危害时间长[4]。目前柑橘线虫的防治方法有农业防治、化学防治、生物防治，以化学防治为主，但是这类杀线虫剂存在使用成本高、毒性大、污染环境等弊端，如破坏生态平衡、造成次要病害发生、药剂残留造成水土污染、引起人畜中毒、抗性丧失等[5]。因此研究开发新型的、既经济又环保的杀线虫剂十分必要。万寿菊Tagete srecta是菊科万寿菊属一年生草本植物，种类多样，在我国广泛分布，其生长对土壤要求不高，栽培容易，向阳喜暖，能耐旱霜，抗性较强，病虫害少，适合大面积的播种。万寿菊化学成分包括噻吩类、精油、色素、黄酮及苷类等，目前国内针对万寿菊中叶黄素的研究报道较多，对于其他成分的研究报道较少[6-7]。噻吩类化合物是万寿菊的特征性次生产物，它有多种生物活性，其中α-三联噻吩是最有代表性的物质之一，含量最高。有研究表明万寿菊的根、茎和花的提取物对松树线虫具有毒杀性，尤以根的粗提物最为显著[8]。国内在苹果的生产上利用间种万寿菊预防苹果根线虫病。而柑橘的生产上极少使用万寿菊作为柑橘根线虫病的防治方法。本文以万寿菊为材料，选取成熟万寿菊的花、茎叶和根3个部位，用不同方法获得粗提物，并试验毒杀砂糖橘园柑橘根线虫的效果，研究万寿菊生物活性物质成分与柑橘根线虫毒杀效率的相关性，为使用万寿菊提取物毒杀柑橘根线虫和研发新型植物源毒杀柑橘根线虫药剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

取成熟的万寿菊花、茎叶、根3个部位，于烘箱中85℃烘干、粉碎，阴凉黑暗处保存备用。

取砂糖橘园感病果树根际土壤，采用改良式贝曼氏漏斗法收集柑橘根线虫备用[9]。

1.2 研究方法

1.2.1 万寿菊花、茎叶、根粗提物的制备

分别称取5.0 g万寿菊花、茎叶、根的干粉，用无菌水、无水乙醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯，于超声波机中（功率900 W，频率40 kHz）提取30 min，常温下提取3次，合并液体后进行减压抽滤，采用旋转蒸发仪60℃减压蒸发至干，得到粗提物[10]，计算各粗提物的提取率。提取率=提取物干重/植物干粉重×100。

1.2.2 不同溶剂粗提物的毒杀线虫率测定

取适量的粗提物用无菌水溶解，稀释成0.000 1 mg/mL、0.001 mg/mL、0.01 mg/mL质量浓度的溶液，分别吸取提取物稀释液3 mL于培养皿中（d=5 cm），加入20条线虫，培养72 h，每隔24 h观察并统计线虫死亡率。对照组为3 mL无菌水中加入20条线虫。

1.2.3 万寿菊粗提物的活性物质测定及其对柑橘根线虫的毒杀能力相关性分析

分别称量100.0 g的万寿菊的花、茎叶、根，剪碎，放置蒸发皿中，在85℃烘箱中烘24 h至恒重，待冷却至室温，取出称重并记录。计算万寿菊各部位的失水率和干物质得率。取万寿菊的花、茎叶、根干粉分别测定生物活性物质含量，黄酮含量的测定采用分光光度法[11]，脯氨酸含量的测定采用茚三酮显色法[12]，总糖、还原糖、多糖含量的测定采用文献[13]的方法，α-三联噻吩含量的测定采用高效液相色谱法，选用C18柱色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（90∶10），流速1.0 mL/min，检测波长352 nm，柱温25℃，进样量10 μL[14]。

1.3 数据分析

试验数据采用Excel 2003进行数据整理，SPSS 25进行单因素方差分析（SSR法）和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂对万寿菊的花、茎叶、根的提取效果

结果见表1。由表1可知，以相同的方法、不同的溶剂对万寿菊的花、茎叶和根部的干粉进行抽提，得率高低的趋势在花、茎叶和根中表现相同，均为无菌水＞无水乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞石油醚。不同溶剂提取的粗提物颜色不同，无菌水粗提物是深黄色，无水乙醇的是绿色，乙酸乙酯的是黄绿色，石油醚的是浅绿色，丙酮的是绿色，说明各粗提物中所含的物质存在差异。

表1 不同溶剂提取万寿菊花、茎叶、根的粗提率（单位：%）

2.2 不同溶剂提取的粗提物的毒杀线虫效果

结果见图1至图5。由图1可知，万寿菊的无菌水提取物稀释成3个浓度，对砂糖橘园根际土壤柑橘根线虫的毒杀效果不同，线虫的死亡率随提取物浓度的增加而升高，并且表现出时间效应，即柑橘根线虫死亡率随着各浓度提取物处理时间的增加而升高。所有处理的线虫死亡率均未超过50%。相同浓度和相同处理时间下万寿菊根提取物的毒杀效果最高，其次是花和茎叶提取物，与对照相比，0.01 mg/mL的提取物在处理24 h时对柑橘根线虫的相对毒杀率为10%（花、茎叶）和15%（根）。

图1 万寿菊花、茎叶、根的无菌水提取物对柑橘根线虫的毒杀效果

由图2至图5可知，万寿菊的无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚和丙酮提取物对柑橘根线虫的毒杀趋势与无菌水提取物的相似，柑橘根线虫的死亡率随提取物浓度和时间的增加而升高，相同浓度和相同处理时间乙酸乙酯、石油醚提取的根提取物的毒杀效果最高，其次是花和茎叶提取物。与对照相比，0.01 mg/mL的提取物在处理24 h时对柑橘根线虫的相对毒杀率表现为：无水乙醇提取物的线虫相对死亡率为70%（花）、75%（茎叶）和95%（根），乙酸乙酯和石油醚提取物的线虫相对死亡率为80%（花）、80%（茎叶）和95%（根），丙酮提取物的线虫相对死亡率为30%（花）、30%（茎叶）和75%（根），与对照相比差异显著。万寿菊不同部位的乙酸乙酯和石油醚提取物在0.01 mg/mL浓度和处理72 h条件下，柑橘根线虫被全部毒杀。不同提取试剂相比，乙酸乙酯提取物的柑橘线虫毒杀效果最高，0.000 1 mg/mL的根提取液、0.01 mg/mL的花和茎叶提取液72 h内线虫死亡率达100%。0.01 mg/mL的根提取液处理24 h线虫死亡率达到100%。相同浓度下，乙酸乙酯提取物的杀虫用时更短。各提取物杀线虫效果：乙酸乙酯提取物＞石油醚提取物＞无水乙醇提取物＞丙酮粗提取物＞无菌水提取物。

图2 万寿菊花、茎叶、根的无水乙醇提取物对柑橘根线虫的毒杀效果

图3 万寿菊花、茎叶、根的乙酸乙酯提取物对柑橘根线虫的毒杀效果

图4 万寿菊花、茎叶、根的石油醚提取物对柑橘根线虫的毒杀效果

图5 万寿菊花、茎叶、根的丙酮提取物对柑橘根线虫的毒杀效率

2.3 万寿菊粗提物的活性物质及其对柑橘根线虫的毒杀能力

结果见表2 至表6。从表2 可知，万寿菊花的失水率＞茎叶的失水率＞根部的失水率，即万寿菊的根获得的干物质最多，达到24.88%。由表3可知，不同部位，万寿菊的各种生物活性物质含量不同，其中黄酮、脯氨酸、总糖、还原糖和多糖含量由多到少的部位依次是花＞茎叶＞根，且花中的含量与茎叶、根中的差异显著，而α-三联噻吩含量与之相反，表现为根＞花＞茎叶，且根中的含量与茎叶、花中的差异显著。

表2 万寿菊花、茎叶、根的干物质率

表3 万寿菊花、茎叶、根干粉中生物活性物质含量

由表4、表5、表6可知，α-三联噻吩含量多少与柑橘根线虫死亡率之间存在显著的正相关性（P＜0.05），万寿菊根部的α-三联噻吩含量最高，对应的根提取物的柑橘根线虫死亡率高。而黄酮、脯氨酸、总糖、还原糖和多糖含量与线虫死亡率之间成负相关，但未达到显著水平。不同的提取方法，二者之间的相关性存在差异。

表4 处理24 h柑橘根线虫死亡率与万寿菊不同溶剂提取物中生物活性物质的相关系数

表5 处理48 h柑橘根线虫死亡率与万寿菊不同溶剂提取物中生物活性物质的相关系数

表6 处理72 h柑橘根线虫死亡率与万寿菊不同溶剂提取物中生物活性物质的相关系数

3 讨论

本文探讨了用成熟万寿菊的不同部位，在不同提取方法和不同处理时间等条件下，提取物对砂糖橘园根际土壤的柑橘根线虫的毒杀效果。

不同提取方法中乙酸乙酯和石油醚的提取物得率最低，但毒杀柑橘根线虫的效果最高，其中尤以根部的最高。而柑橘根线虫死亡率与万寿菊提取物中的α-三联噻吩含量显著正相关，α-三联噻吩属于芳香性杂环化合物，脂溶性较强、水溶性较差[15]，所以不同溶剂提取的α-三联噻吩含量不同，导致对柑橘根线虫毒杀效果不同。万寿菊中的α-三联噻吩具有显著的光活化杀虫活性，在有光的环境会产生光分解[16]，因此α-三联噻吩在万寿菊干燥和提取的过程中会产生一定的损耗，一方面在干燥、提取和保存过程中需要避光操作，另一方面提供了利用α-三联噻吩毒杀柑橘根线虫的其他思路，比如间种万寿菊和利用万寿菊粉碎物覆盖等方法辅助杀灭柑橘根线虫。

为了生产上应用便利，分别提取了万寿菊花、茎叶和根3个部位的α-三联噻吩，其中根的含量最多，将茎和叶合并提取，α-三联噻吩的含量最少，不及花的。而阚春刚等[17]的研究结果显示，万寿菊茎的冷浸提取物中α-三联噻吩的含量最高，其次为根，而叶和花中的含量极少。本文中测得万寿菊根提取物中α-三联噻吩的含量为14.96 mg/g，由此可以看出超声波提取的方法优于冷浸提取。试验证明，万寿菊根的粗提物对柑橘根线虫的毒杀效果最高，且随着粗提物浓度的增大，对柑橘根线虫的毒杀效果也呈升高趋势，当粗提物稀释液浓度达到0.01 mg/mL时，毒杀效果可达100%。并且发现，万寿菊粗提物对柑橘根线虫的毒杀效果随时间的延长而增强。

本文中黄酮、脯氨酸、总糖、还原糖和多糖与线虫的死亡率之间没有显著正相关关系，虽然黄酮对线虫具有抗氧化损伤作用，多糖中可能有损伤线虫的部分活性物质存在，但相比万寿菊中噻吩类化合物的作用，其可能只是存在部分的辅助作用。用成熟万寿菊的提取物进行小鼠急性毒理学实验，实验结果得出万寿菊提取物是无毒的[18]，因此可作为符合现代环境保护条例的绿色环保植物农药，而对于α-三联噻吩这一成分是否就是万寿菊根提取物的最主要有效杀柑橘根线虫的成分，还需要进一步的实验证据。

砂糖橘的生产可以充分利用万寿菊的生长特点和作用，行间间种矮生万寿菊，既具有观赏性，又可研究万寿菊根部分泌物的杀线虫作用；成熟后收获全株，花中可以提取黄酮等生物活性物质，并用于医药、食品和美容保健等行业，提供高附加值；茎和叶直接粉碎后还田，一则可以作为绿肥，二则可以辅助毒杀线虫；根可以用于提取噻吩类化合物，制备植物源农药。

4 小结

在万寿菊的花、茎叶和根中，根部粗提物对柑橘根线虫的毒杀作用最强，不同提取方法中乙酸乙酯和石油醚粗提物对柑橘根线虫毒杀效果最高。随着粗提物浓度增大，对柑橘根线虫的毒杀效果也有提升趋势，当提取物稀释液浓度达到0.01 mg/mL 时，毒杀效果可达100%。粗提物对柑橘根线虫的毒杀效果随时间的延长而提升。α-三联噻吩是毒杀柑橘根线虫的主要有效成分之一，并在根中含量最多。黄酮、脯氨酸、总糖、还原糖、多糖等生物活性物质不是毒杀柑橘根线虫的主要成分。