长链非编码 RNA 生长停滞特异性转录因子5在宫颈癌中的作用研究进展

徐静纯，王 聪

(南京医科大学第一附属医院病理科，江苏 南京 210029)

宫颈癌是女性第2大常见恶性肿瘤，也是全球第4大癌症死亡原因，其病死率仅次于乳腺癌。约90%的宫颈癌病例发生在发展中国家，中国每年有超过 50 000例女性死于宫颈癌[1-4]。人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持续感染与宫颈癌的发病密切相关，研究已证实HPV是引起宫颈癌和癌前病变的必要因素[5-8]。目前，对于宫颈癌的治疗方式多采用手术、放射治疗及辅助化学治疗等方法，但患者的5 a生存率始终不尽如人意[9]。因此，进一步研究宫颈癌的致病机制，对寻找新的药物靶点和治疗策略具有重要意义。长链非编码RNA(long chain non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的RNA，虽然其没有编码蛋白质的功能，但越来越多的研究表明，lncRNA与基因表达、细胞增殖、细胞凋亡等多种病理生理过程有关[10-12]。生长停滞特异性转录因子5(growth arrest special 5，GAS5)是位于人染色体1q25位点的一个lncRNA，其与多种肿瘤的临床病理特征如TNM 分期、组织学分级、肿瘤大小和远处转移等显著相关[13-14]。当GAS5表达下调时，可抑制结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌等多种实体肿瘤的发生、发展[15-20]。有研究显示，GAS5在宫颈癌的发生、发展及治疗中发挥重要作用[13,21-29]。本文就GAS5在宫颈癌发生发展中的生物学功能研究进展进行综述，旨在为宫颈癌的诊断、治疗及预后评估提供参考和方向。

1 GAS5 简介

GAS5是从生长抑制细胞的减法杂交cDNA文库中分离出来的属于5′-终端帽子结构家族的RNA成员，其位于与淋巴瘤相关的1q25位点。GAS5通过其内含子发挥生物学功能，该内含子可被转录为10个框式C/D小核仁RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)分子和2个成熟的lncRNA(GAS5a和GAS5b)[30-32]。GAS5具有短的开放阅读框，但不能编码蛋白质，可作为snoRNA宿主基因来发挥生物学功能[33]。GAS5通过3种基本作用模式充当基因调控元件：第1种是直接与靶基因结合；第2种为间接机制，涉及GAS5与调节蛋白的结合以及随后的基因转录调控；第3种是次要的间接作用方式，即形成GAS5/蛋白质复合物，进一步作为转录基因的调控元件[34]。

最初，研究者发现GAS5在人类T细胞中具有生物活性，并证实GAS5过表达可诱导细胞凋亡并使S期的细胞数量减少，而GAS5低表达时则结果相反，表明GAS5的过表达可抑制T细胞生长[35]。GAS5同样影响正常组织的细胞周期进程，因此对于正常细胞的生长停滞至关重要[36]。GAS5在非小细胞肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、食管癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌及肾细胞癌等多种恶性肿瘤中呈低表达，且这种异常表达与肿瘤大小、疾病分期和预后呈负相关[15-20,37-41]。其中在GAS5与宫颈癌的关系中,GAS5 可能与宫颈癌细胞的凋亡、增殖和侵袭及肿瘤放化疗抵抗相关[13,21-25]。因此，GAS5 有望成为宫颈癌干预治疗的潜在靶点。

2 GAS5 在宫颈癌组织中的表达

有研究表明，GAS5在多种生物过程中发挥重要作用，主要包括细胞生长和肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、迁移等[14,25]。CAO等[21]和YANG等[26]采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术分析GAS5在宫颈癌组织中的表达，结果提示，宫颈癌组织中GAS5的表达水平显著低于邻近正常组织；同时，相关性分析发现，GAS5表达水平与FIGO分期、血管浸润和淋巴结转移密切相关，而与患者的年龄、肿瘤大小、组织学和分化等其他参数无关。此外，生存分析发现，GAS5表达水平更低的宫颈癌患者总生存期明显缩短[27]。

3 GAS5 表达对宫颈癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响

为了评估GAS5在宫颈癌中的生物学作用，CAO等[21]采用四甲基偶氮唑盐法(methylthiazolyl-tetrazolium，MTT)测定GAS5对细胞增殖的影响，结果显示，与非特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)组相比，GAS5特异性siRNA转染的细胞生长速度显著增加，即GAS5的下调会促进宫颈癌细胞的增殖；此外，细胞伤口愈合测定和Transwell侵袭测定结果显示，与非特异性siRNA组相比，GAS5特异性siRNA转染的宫颈癌细胞的迁移率显著上调，侵袭能力显著增加。因此，GAS5的下调可能促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭。另外，YANG等[13]通过转染GAS5的重组真核载体(protruding clustered DNA-GAS5,pcDNA-GAS5)成功建立了过表达GAS5的人子宫颈鳞状细胞癌细胞SiHa和人子宫颈表皮癌细胞ME-180，经MTT检测发现，GAS5的外源表达显著抑制了SiHa和ME-180细胞活力,表明GAS5的过表达阻碍了宫颈癌细胞的生长。ZHANG等[28]为了分析GAS5在细胞增殖中的调控作用，将pcDNA-GAS5和阴性对照物pcDNA3.1转染到C33A和HeLa宫颈癌细胞中，CCK-8分析结果显示，GAS5的过表达显著降低了C33A和HeLa宫颈癌细胞的增殖；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色证实，2种细胞系中的GAS5过表达均通过诱导凋亡进而降低癌细胞的活力，随后进行的膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双重染色进一步证实，GAS5过表达导致癌细胞增殖减少是由于诱导了癌细胞凋亡。研究者还发现，宫颈癌细胞的增殖降低是由于细胞周期蛋白B1水平下降引起GAS5过表达，从而诱导G2/M细胞周期停滞[28-29]。以上研究均表明，GAS5的低表达促进了宫颈癌的侵袭转移，进一步表明GAS5 在宫颈癌中具有重要的基础及临床研究前景。

4 GAS5 的分子海绵作用

近年来RNA调控网络分析揭示，lncRNA在调控miRNA的表达和生物学功能方面发挥分子海绵的作用，即lncRNA可作为竞争性内源RNA吸附微RNA (microRNA,miRNA)，参与靶基因的表达调控，并在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[42-43]。 为了验证GAS5是否具有类似的功能，YANG等[26]应用TargetScan、miRanda和DIANA等在线生物信息学软件预测相应的miRNA，结果显示，miR-196a和miR-205可能被GAS5吸附；为了进一步验证GAS5是否可以与miR-196a和miR-205直接结合,其构建了GAS5野生型和突变型荧光素酶载体，并分别与miR-196a或miR-205共转染，通过荧光素酶报告基因测定、RNA免疫沉淀测定和qRT-PCR 分析结果证实，GAS5可充当miR-196a和miR-205的分子海绵，通过吸附miR-196a和miR-205进而下调其表达水平,从而使叉头框蛋白O1和蛋白酪氨酸磷酸酶基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)表达升高，进而抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭。有研究通过生物信息学软件分析发现，GAS5和miR-106b存在潜在结合序列，并通过RNA免疫沉淀和RNA下拉实验证实，GAS5是miR-106b的分子海绵，其高表达可通过下调miR-106b来增强宫颈癌的放射治疗敏感性[23,35]。

5 GAS5与宫颈癌的顺铂耐药性

目前，宫颈癌的主要治疗方法是根治性子宫切除术和盆腔淋巴结切除术、放射治疗、化学治疗单独或联合使用。基于顺铂的同步放化疗是局部晚期宫颈癌的标准治疗方案[44]。研究发现，以顺铂为基础的放化疗后的巩固化学治疗可以降低宫颈癌患者远期复发率，并提高患者的总生存期和无进展生存期[45]。然而，在宫颈癌治疗期间，顺铂的耐药性极大地限制了其临床应用和疗效[46]。为了研究GAS5表达对顺铂耐药性的影响，温启荣[25]和WEN等[47]在不同浓度梯度的顺铂(1、2、3、4、5、6、10、15、 30 mg·L-1)处理后的宫颈癌细胞中过表达或沉默GAS5和miR-21，并分别检测细胞存活率，结果表明，GAS5和miR-21可以调节宫颈癌细胞对顺铂治疗的敏感性；进一步研究发现，GAS5可能通过调节PTEN的表达水平影响丝苏氨酸蛋白激酶的磷酸化，进而通过miR-21影响宫颈癌细胞对顺铂的耐药性。此外，FANG等[48]研究发现，在磷酸化信号转导和转录激活子3的调节下，GAS5通过GAS5/miR-21/程序性死亡因子4途径增强宫颈癌细胞对顺铂的敏感性。研究表明，年轻女性患者宫颈癌细胞GAS5多呈低表达[28,48]，因此，增加 GAS5的表达有望提高年轻宫颈癌患者对顺铂的敏感性，进而改善年轻宫颈癌患者的预后。

6 GAS5与宫颈癌的放射治疗敏感性

目前，放射治疗是宫颈癌的常用治疗方法[44]，但肿瘤细胞对放射治疗的抵抗力是宫颈癌患者放射治疗失败的主要原因[49]。为了探索GAS5表达对宫颈癌细胞放射治疗敏感性的影响，有研究者用pcDNA-GAS5或siRNA-GAS5转染了SiHa和ME180细胞，结果表明，GAS5的过表达增加了宫颈癌细胞对放射治疗的敏感性；且通过生物信息学软件(DIANA，lncBase prediction v.2)的目标预测分析发现，GAS5是miR-106b的分子海绵；并进一步通过体内和体外实验来研究GAS5/miR-106b在宫颈癌放射治疗敏感性中的分子机制，结果发现，放射治疗抵抗组宫颈癌患者的肿瘤组织中GAS5表达水平较放射治疗敏感组降低，但miR-106b较放射治疗敏感组升高，同时发现GAS5可能是通过miR-106b来影响宫颈癌对放射治疗的敏感性[23,50]。综上所述，宫颈癌放射治疗联合GAS5 的过表达可能会是宫颈癌治疗的有效策略。

7 GAS5在宫颈癌免疫治疗中的应用前景

晚期宫颈癌患者传统的治疗方式主要为放射治疗和化学治疗，由于放射治疗敏感性的下降和化学治疗耐药性以及治疗以后的易复发性，以上治疗方法效果欠佳[46,49]。目前，基于肿瘤微环境的免疫治疗已成为肿瘤治疗的研究热点，免疫治疗已成为包括宫颈癌在内的大多数肿瘤的一种新型治疗选择[51]。研究发现，宫颈癌的进展、转移和预后受肿瘤免疫微环境的影响，参与宫颈癌进展的lncRNA(尤其是与免疫相关的lncRNA)在肿瘤免疫过程中发挥重要作用[52]。XU等[53]研究确定了与宫颈癌免疫治疗和预后相关的多个lncRNA在宫颈癌的发生、发展中发挥重要作用，其可能成为筛查宫颈癌和鉴别免疫治疗敏感性患者的潜在标志物。GAS5作为lncRNA中重要的一员，是一种肿瘤抑制因子，其参与多种肿瘤细胞的发生、发展[13-14]。最近，有研究发现，GAS5与系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病有关[54]。目前，国内外尚无GAS5与宫颈癌免疫相关的研究，提示研究人员未来可以进行相关研究，为宫颈癌免疫治疗提供新思路。

8 小结与展望

综上所述，GAS5在宫颈癌细胞存活、生长分化及侵袭迁移中发挥关键作用。同时，越来越多的研究表明，GAS5是一种参与宫颈癌进展的新型分子，可成为潜在的预后生物标志物和治疗靶标。随着分子生物学基础研究的不断推进,GAS5有望在宫颈癌的早期诊断、基因治疗、预后评估及靶向和免疫治疗等方面展现更大价值。因此，需要更多的实验和临床研究来探索 lncRNA 参与宫颈癌侵袭、转移、化学治疗抗性、放射治疗抗性以及靶向免疫治疗的机制，为未来更好地诊断和治疗宫颈癌提供新思路。