松材线虫基础生物学研究进展

孙薇，周立峰，陈静，胡加付

(1. 浙江农林大学，浙江 杭州 311300；2. 临海市林业技术推广和场圃旅游服务总站，浙江 临海 317000)

松材线虫Bursaphelenehus xylophilus是一种严重森林病原线虫，其引起的松材线虫病是世界范围内有历史记载以来最为严重的森林病害。 由于松材线虫的适应能力强、寄主分布范围广，该病在我国发生严重，造成了巨大的经济损失和生态灾难。

迄今为止，国内外学者对松材线虫病开展了大量研究，取得了显著进展，主要集中于松材线虫病的病原鉴定、传媒昆虫、侵染循环、扩散机制、致病机理、监测预警和防控措施等方面。 在松材线虫本身的基础生物学研究方面，近年来也取得了显著进展，但很多关键领域的研究仍较薄弱，包括松材线虫扩散型幼虫和繁殖型幼虫相互转变的分子机制、松材线虫环境适应性进化、性别决定与分化的分子调控机理，以及松材线虫取食行为和与寄主松树互作的生物学过程等等。 基础生物学研究不足在很大程度上限制了病害系统的基础理论研究和发展，也对开发特异性的防控技术形成了障碍。 笔者瞄准松材线虫本身的基础生物学研究，从个体发育、生理代谢、遗传进化和行为学等方面总结国内外研究进展，分析存在的问题和不足，以期为深入开展松材线虫病理论基础研究提供参考。

1 发育生物学研究进展

与模式线虫秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans相比，松材线虫的发育生物学研究大多停留在形态观察阶段，对发育的分子调控过程缺乏深入系统的研究。 Hasegawa 等研究发现，松材线虫的受精作用在雌性成虫输卵管和四轴柱的连接通道中进行，在25 ℃条件下，卵细胞和精细胞融合后约20 min就可以在外围形成一层薄而透明的受精卵壳，受精卵呈长椭圆形，在雌虫体内不发育；受精卵产出后，首先会在侧面中部出现雌性原核，几分钟后在受精卵的一个顶端显现雄性原核，随后雌性原核与雄性原核相互靠近，并在受精卵中部融合[1]。 进一步观察发现，松材线虫的第1 次卵裂发生在产卵后约60 min，形成大小不等的AB 细胞(大)和P1细胞(小)；约10 min 后，AB 细胞先分裂成ABp 和ABa 两个细胞，进入三胞期，再过10 min 后P1分裂形成P2和EMS 两个细胞，进入四胞期；从四胞期到八胞期，需要约10 min[2]。 此后，随着细胞的持续分裂，受精卵内出现了明显的组织结构，有一层较小的细胞(外胚层)包裹着一群较大的细胞(内胚层)，整个受精卵进入囊胚期(blastocyst stage)，从二胞期到囊胚期大约需要6 ～7 h。 之后，进一步发育并进入利马豆期(lima bean stage)，1.5 h 后进入蝌蚪期(tadpole stage)。 再过约1.5 h，内陷到卵的一端，形成二折结构，即二折期(loop stage)。 二折期胚胎已经可以蠕动，变细、伸长，约3 h 后即可发育为四折的1 龄幼虫。 1 龄幼虫的唇区、口针、中食道球等器官尚未形成。 约1 h 后，1 龄幼虫蠕动减缓，开始第1 次脱皮，进入2 龄幼虫阶段。 2 龄幼虫唇区、口针、中食道球等器官清晰可见，不断地在卵壳内蠕动，约4 h后，卵壳破裂，幼虫孵化[3]。 从受精卵产生到2龄幼虫孵化大约需要30 h。

松材线虫刚孵化出的2 龄幼虫体色较淡，取食后肠内可见颗粒状物质，此后体色逐渐加深，唇区出现缢缩，中食道球变大，体长为220 μm 左右，约1 d后脱皮成3 龄幼虫。 3 龄幼虫体长为450 μm 左右，生殖细胞清晰可见，取食约1 d 后蜕皮为4 龄幼虫。4 龄幼虫唇区缢缩明显，生殖腺快速增大，雌、雄生殖器官形成，此时体长达到600 μm 左右，4 龄幼虫持续时间约1.5 d。 4 龄幼虫脱皮后为成虫，成虫体长持续增加，雌、雄成虫很快交配产卵。 成虫生殖腺较大，各发育阶段的生殖细胞清晰可见，雌成虫有阴门盖，雄成虫交合刺明显。 雌、雄成虫交配时长约为23 min[4－5]，交配后雌虫随即开始产卵，产卵期长达1 周，平均产卵约79 粒[6]。 在25 ℃条件下，松材线虫完成1 代需要约5 d[7]，30 ℃条件下松材线虫生长发育最快，但高于33 ℃发育速度将被抑制，其发育的最低温度为9.5 ℃[8－10]，但具有较强的温度适应能力，并且经过低温驯化后，耐寒能力随着驯化时间的延长而显著提高[11]。

松材线虫发育分子生物学研究进展缓慢，根本原因在于基因敲除和基因编辑技术尚未在松材线虫体内获得成功。 松材线虫的体宽较窄，只有50 μm左右，现有的显微注射技术会对松材线虫的性腺产生较大伤害，甚至直接将身体一分为二，大部分个体都因伤害过重而死亡。 另外，松材线虫为雌雄异体，极少数能够存活的个体要完成伤口愈合、顺利交配，并获得稳定遗传性状的下一代，成功率极低。 因此，国内外对松材线虫发育的分子生物学研究大多采用浸泡RNAi 技术，由于该技术干扰效率不高，往往存在研究结果不稳定和重复性较差等问题。 周立峰 等研究发现，松材线虫mab－3基因具有雄性特异性，在松材线虫的精子发生和雄性个体发育过程中具有十分重要的作用，并能够调控雄性成虫的交配行为；mab－3基因被干扰之后，松材线虫雄性成虫的体长和体内的精子大小都明显变小，雄性成虫不能进行正常的交配，无法准确定位雌虫的阴户部位，交配出错率明显上升[12]。 已有研究结果表明，很多基因被干扰之后，松材线虫的胚胎孵化率都会显著降 低， 如Bxy－octr－1、madd－4、Bxy－egl－30、Bxy－fuca和Bxy4022等[13－17]，这可能与胚胎发育的复杂生物学过程有关，同时表明松材线虫的胚胎发育可能受到多个基因的调控。 有趣的是，虽然松材线虫长期生活在树体之内，但光照能够显著地抑制其个体发育，其中蓝光的抑制作用最强，并显著抑制其种群数量增长[18－19]。 早在20 世纪80 年代，Kaneko 就已经证实光照能够抑制松材线虫病的发病进程[20]。

扩散型Dauer 幼虫的形成是松材线虫病病害流行的基础，但国内外对松材线虫Dauer 幼虫的形成机理尚没有取得突破性进展。 Kikuchi 等研究发现了20 多个与松材线虫扩散型幼虫形成相关的基因，包括insulin/IGF－1 路径中的daf － 2、daf － 18、daf－16、age－1、pdk －1、akt －1、akt －2和sgk －1，TGF－β路径中的daf －1、daf －3、daf －4、daf －7、daf－8、daf－14、scd －1、scd －2、bra －1和king －8，鸟苷酸环化酶路径中的daf －11、tax －2和tax －4，以及类固醇激素路径中的daf －9和daf －12[21－22]。赵利蔺等研究发现，松墨天牛在羽化过程中释放大量C15 －C18 脂肪酸乙酯，启动松材线虫Insulin 和DA/DAF－12 信号通路，改变发育途径，进而诱导扩散型3 龄幼虫(LⅢ) 形成扩散型4 龄幼虫(LIV)[23]，但对转型发育的生物学过程没有开展深入研究。 对松材线虫部分daf基因的生物学功能进行分析发现，基因daf－9和daf －12对松材线虫扩散周期具有一定的调控作用[24]；采用RNAi 技术分析松材线虫基因daf－6的生物学功能发现，该基因能够在一定程度上抑制松材线虫扩散型幼虫的形成[25]；根据daf－8和akt－1基因的研究结果，推测松材线虫在休眠幼虫Dauer 形成之前的繁殖型2 龄幼虫(J2)期启动了insulin/IGF － 1 信号路径和TGF－β信号路径，但这2 个基因都不能够单独调控松材线虫Dauer 幼虫的形成[26－27]。

2 生理代谢研究进展

松材线虫的致病机理是当前松材线虫病研究的前沿和热点，尽管难以获得直接的证据，但不少学者认为松材线虫分泌的纤维素酶和毒素是引起松树死亡的主要原因。 因此，现有生理代谢研究大多数是基于松材线虫的致病性而开展的纤维素酶和毒素基因的生物学功能验证。 研究发现，松材线虫分泌的纤维素酶能够破坏松树薄壁细胞的细胞壁和细胞膜，导致松脂从树脂道中渗漏并扩散到相邻的管胞中，使松树水分输导受阻，引起松树萎蔫[28－29]；进一步研究发现，松材线虫基因组中有3 个类毒液过敏原家族蛋白，能诱导寄主松树的防御反应和过敏反应，如α－蒎烯大量积累和细胞死亡[30－31]，干扰松材线虫类毒液过敏原蛋白后，松材线虫在寄主体内的迁移率明显降低，致病力降低[32]。

作为病原生物，松材线虫侵入寄主之后必然引起松树一系列的防御反应，松树次生代谢产物的大量产生是其防御反应的重要手段，如蒎烯等次级代谢产物；松材线虫对松树次级代谢产物的分解代谢过程，是其成功入侵和定殖的必要条件[33－34]。 研究发现，松材线虫能够给寄主松树次生代谢产物加上额外的功能团，使其更适合作为下游反应的底物，随后进行解毒代谢，最后排出体外。 例如，松材线虫的细胞色素P450 家族的基因拷贝数明显大于秀丽隐杆线虫，其功能是可以改变次生代谢产物的功能基团，使其更适合作为下游反应的底物[22，35]；P450 家族的CYP33C9、CYP33C4和CYP33D3基因与松材线虫蒎烯类物质代谢相关，能提高松材线虫在寄主体内的适应性，从而增强松材线虫繁殖率和致病性，是松材线虫入侵过程中的重要关键因子[36－38]。 与这些研究结果类似，王璇认为，松材线虫的激发基因能够诱导松树的防御反应，引发松树体内蒎烯类有毒次生代谢物质的大量积累，松材线虫解毒基因随之大量表达，转化利用并消耗松树的次生代谢产物[39]。 此外，林世锋 等认为，松材线虫食道腺分泌的Expansin 是一种细胞壁松弛蛋白，具有软化寄主松树细胞壁作用[40]。 进一步研究发现，松材线虫食道腺细胞可以特异性表达一类依赖于Ca2＋的果胶酸裂解酶，通过口针分泌到寄主松树组织内部，促进果胶类物质分解，以利于其取食[41]。

在松材线虫的生理代谢方面，对脂肪和蛋白质的合成与分解等传统生理代谢研究尚未见报道，而脂肪粒的大量形成是松材线虫Dauer 幼虫最重要的特征之一，深入研究其形成的生物学过程和分子调控机制具有十分重要的科学意义，也是亟待研究的科学问题之一。

3 遗传进化研究进展

松材线虫源自北美洲[42－43]，在分类学上属于寄生滑刃科Parasitaphelenchidae 伞滑刃亚科Bursaphelenchinae 伞滑刃属Bursaphelenchus[44]。 与松材线虫亲缘关系最近的物种是拟松材线虫Bursaphelenchus mucronatus，两者在形态学和生物学特性等方面高度相似，拥有相同的食物资源，共享同样的传媒昆虫，并在空间生态位上高度重叠，仅在致病力和雌性成虫的尾尖形态上有所差异[45－46]。 因此，松材线虫与拟松材线虫是否是同一个物种以及两者之间的进化关系一直是学术界关注的焦点。 Kanzaki 等通过对rDNA 的18S、5.8S、ITS1、ITS2 序列及COI 基因的部分序列系统发育分析认为，拟松材线虫起源于欧亚大陆的东部，而松材线虫则是由欧亚大陆传入北美的拟松材线虫分化而来[43]。 Pereira 等利用COI，ITS2，28S rDNA 等分子生物学手段，综合全球范围内已报道的拟松材线虫、松材线虫的相关分子生物学信息，进一步证实了Kanzaki 等的假说，即松材线虫起源于北美，而拟松材线虫起源于欧亚大陆[44]。 周立峰 等人应用ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记对东亚地区不同地理来源的松材线虫和拟松材线虫进行种群遗传结构分析发现，拟松材线虫形成更多的独立区域，而松材线虫紧紧聚在一起，不同地理来源的拟松材线虫与松材线虫在遗传上没有交叉[45]。 因此，尽管松材线虫和拟松材线虫的亲缘关系很近，但它们仍然是2 个物种。采用第三代基因组测序技术对松材线虫和拟松材线虫进行基因组测序，发现拟松材线虫无论是基因组还是基因体量均比松材线虫略大；进化分析结果表明，松材线虫进化速率比拟松材线虫略快，但与

Caenorhabditis briggsae，C.elegans，Ditylenchus destructor，D.melanogaster和Strongyloides ratti等其他物种相比，进化速率居中，而分化时间却是最晚的，这在一定程度上支持了松材线虫可能是拟松材线虫一个分支的推测(数据待发表)。

松材线虫生活在松树体内，大部分时间以微生物为食。 同源性进化分析结果表明，松材线虫基因组中的一些与寄生相关的基因可能是通过水平转移从微生物基因组中获得的[46－48]。 例如:松材线虫基因组中的一些独特的细胞壁降解酶——糖苷水解酶45 家族纤维素酶，是其他线虫所不具有的，但和真菌中的相关基因同源性最高[22]。 另外，松材线虫的β－1，3 －葡聚糖苷酶和β－1，4 －葡聚糖苷酶的基因与细菌纤维素酶基因同源性较高，这可能是在演化过程中从细菌基因组整合到松材线虫基因组的基因水平转移结果[49]。

松材线虫与拟松材线虫的亲缘关系极为接近，能否进行种间杂交，以及杂交后代的繁殖力和致病力等问题很早就引起人们的重视。 Mamiya 等报道松材线虫与拟松材线虫的杂交F1 代不可育[50]；Bolla 等报道部分松材线虫和拟松材线虫的杂交F1代可育[51]；Braasch 通过不同地理来源的松材线虫与拟松材线虫杂交试验发现，德国拟松材线虫和日本松材线虫与其他国家的松材线虫和拟松材线虫的种间杂交能够成功，且后代线虫与日本松材线虫株系能够进一步杂交并产生有致病力的后代[52]；刘伟 等用中国不同株系的拟松材线虫和松材线虫与其他国家的拟松材线虫和松材线虫进行种间杂交发现，能够杂交成功，但后代数量偏少且大多不育[53]；季宏铁研究发现，大部分杂交组合的后代经过1 代或多代培养后死亡，无法形成可延续的种群，只有极少数组合产生可延续的杂交后代[54]；贲爱玲 等通过正交和反交试验发现，松材线虫的雄虫与拟松材线虫的雌虫(正交)的杂交率，最高可达93.8%，显著高于反交的杂交率，但杂交后代线虫普遍存在畸形和死亡率高的现象[55]；应晨希 等通过4 个不同地理种群松材线虫和拟松材线虫的杂交结果发现，虽然能够完成杂交，但成功率偏低，松材线虫的雄虫比拟松材线虫的表现出更强的杂交趋向，具有明显的不对称种间杂交优势[56]。 拟松材线虫与松材线虫能够完成种间杂交，但杂交后代的繁殖能力尚未得到一致性结论，这可能是由所用线虫株系不同造成的。 另外，经过数代人工饲养之后，松材线虫和拟松材线虫的杂交能力可能也会有一定的下降。 在自然条件下，松材线虫和拟松材线虫处于完全的混生状态，这种条件下的杂交率尚有待进一步研究。 与拟松材线虫相比，松材线虫具有更强的繁殖能力，其种群数量极大，即使只有极低的杂交效率，也会有效放大其种间不对称交配效应，增强其种间竞争能力，并最终占据生态位，这一点已经被Cheng 等[57]和季锦衣[58]所证实。 无论在实验室还是在野外，松材线虫与拟松材线虫混合培养时都会发生竞争替代现象，即混合种群中松材线虫的种群数量会逐渐占优并最终替代拟松材线虫[57－58]。

按照科学界对“种”的定义，如果松材线虫和拟松材线虫是2 个不同的种，应该存在生殖隔离，即相互之间不能交配，或者交配产生的后代不可育。 目前，学术界根据分子生物学鉴定结果公认松材线虫和拟松材线虫是2 个不同的种，但已有的研究结果表明，他们之间确实能够交配，且杂交后代在几代以内能够成功再育。 虽然杂交后代能否在自然条件下永久延续尚有待进一步确认，但已经对“种”的定义提出了挑战。 在分子生物学鉴定技术出现之前，学术界对于不同物种的划分是基于个体形态的差异，且大多数是定性描述的结果，没有定量的衡量指标，而生物的个体形态存在多样性，这为物种分类带来了困扰，科学界对于“种”的定义是对传统物种形态分类结果的进一步确认，并以生殖隔离作为基本衡量标准。 按照传统的形态分类和科学界对“种”的定义，松材线虫和拟松材线虫完全可以划归为同一个物种。 但现代分子系统学是根据遗传物质核酸序列的相似度确认生物的种类，当特定片段核酸序列的相似度大于一定的数值时便认为是同一个物种，并没有将生殖隔离作为新物种确认的标准。 因此，随着分子技术的进一步发展和应用，尤其是更多没有严格生殖隔离但核酸序列又存在一定差异现象的出现，也许科学界需要对“种”的内涵重新定义。

4 行为学研究进展

在自然条件下，松材线虫长期生活在树体内，且个体微小，难以跟踪，故国内外对松材线虫的行为学只有一些零星的报道，缺乏深入系统的研究。 赵利蔺 等研究发现，刚羽化的媒介昆虫表皮硬化前产生长链蛔甙类物质(Asc －C9)引诱松材线虫进入气管，从死亡松树转移到媒介昆虫[59]。 进一步研究发现，媒介天牛在取食补充营养和产卵过程中代谢和呼吸速率增加，导致其气管内CO2含量升高，高浓度的CO2能够驱动松材线虫从媒介天牛气门溢出，并通过取食或产卵造成的伤口进入新的寄主松树[60]。 实验室研究结果表明，松材线虫不同发育阶段的繁殖型幼虫表现出不同的趋光性，J2 幼虫对短波长的蓝光、紫光以及复合白色光源具有一定的趋向性，而J3、J4 和成虫对紫光却表现出明显的趋避性。 与繁殖型J4 幼虫不同，扩散型DLIV幼虫对所有波长的可见光均表现出一定的趋避性，这在一定程度上促进了DLIV幼虫在寄主转移过程中向松树体内移动[61]。

在繁殖行为学方面，Liu 等研究了松材线虫的交配行为，将整个交配过程分为搜寻、接触、交尾和逗留4 个阶段，并进一步分解为逡巡、靠近、相遇、触摸、卷曲、定位、固定、射精、解尾、静止和徘徊等11个动作，整个过程持续80 min 左右，平均交尾时长为23 min。 与高等动物相似，松材线虫在交配过程中表现出明显的性吸引，在性别比例不平衡时，雌虫和雄虫都存在激烈的性内竞争[4－5]。 理永霞 等进一步研究发现，雌雄比为3.4∶1 时松材线虫的繁殖成功效率最高，种群增长速度最快[62]，其内在的生物学机制尚有待进一步研究。 尽管松材线虫与寄主松树之间的互作关系是松材线虫病病害系统的核心要素，但尚未见有松材线虫对松树取食行为的报道。本研究团队初步观察结果表明，松材线虫在取食松质食物时口针外露，并用口唇反复多次接触，这可能是其利用味觉进行食物选择的过程；与取食松质食物不同，松材线虫在取食灰葡萄孢Botrytis cinera的过程中，先将身体移动到合适的位置，通过头部伸缩将口唇对准菌丝的横切面，再用口针将菌丝送进口腔，表现出明显的移动、定位、伸缩、取食和吞咽动作(待发表)。

综上所述，国内外对松材线虫的基础生物学开展了较多的研究，并取得了一定的进展，但现有研究大多停留在现象观察水平，尚没有在分子水平上揭示其内在机制，存在许多亟待解决的科学问题，这在很大程度上阻碍了新型防控技术的研究和开发。 因此，突破松材线虫转基因研究技术瓶颈，建立成熟的松材线虫病分子研究技术体系，深入开展松材线虫的基础生物学研究，并针对病害流行的关键薄弱环节开发特异性的防控技术，应该是未来松材线虫病研究的核心和重点。