东方蜜蜂微孢子虫对蜜蜂健康的影响

陈 恒，刘一冰，徐 浩，蔺哲广，吉 挺

（扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009）

蜜蜂作为自然界最主要的授粉昆虫，对经济发展和生态多样性的保护具有重要价值[1]。然而自2006年以来，在美国、欧洲等多个国家和地区相继发生蜂群崩溃失调症（colony collapse disorder,CCD），给全球西方蜜蜂（Apis mellifera）的养殖造成了巨大损失。1996年，东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）首次在东方蜜蜂中被发现[2]，2006年，在西班牙的西方蜜蜂（Apis mellifera）中被发现，随后在正常和患病的蜂群中多次被发现并报道。2007年，美国、巴西、中国、越南和8个欧盟国家也有对N.ceranae的相关报道[3-4]。Higes等[5]证明了N.ceranae和蜂群的死亡之间存在相关性，虽然此研究存在争议，但仍有大量研究表明N.ceranae与蜂群崩溃间存在间接联系[6-8]，并且长期的无症状潜伏期似乎可以解释蜂群崩溃之前没有明显症状的原因[9]。

N.ceranae于1996年在东方蜜蜂（Apis cerana）中首次被发现[10]，其主要寄生在蜜蜂中肠 上皮细胞内，以孢子的形式在宿主间传播，目前已知可以感染A.cerana和A.mellifera，并且在A.melllifera中流行率更高，它以宿主体液为营养发育增殖，从而对宿主健康造成影响。新的分子证据将微孢子虫划分到真菌界，是一种高度特化的寄生真菌[11]。随后，这种流行病被证实为一种跨越地理界限的病原体，并在加拿大、澳大利亚、乌拉圭、日本、智利、约旦和沙特阿拉伯等众多国家的蜂群中均被检测到。此外，N.ceranae也在小蜜蜂（Apis florea）、大蜜蜂（Apis dorsata）中被发现[12-13]，甚至在蜜蜂总科下的其他属中也有发现，包括熊蜂（Bombus）、壁蜂（Osmia）、地蜂（Andrena）、无刺蜂（Melipona）[14-16]。调查发现N.ceranae可以适应各种各样的生态气候，如西班牙的地中海气候[2]、加拿大的温带气候[17]、墨西哥的热带气候[18]，以及沙特阿拉伯的高温干旱气候[19]。此外，N.ceranae感染的季节性流行规律似乎并不明显，据报道在西班牙冬季[5]的感染水平最高，加拿大的夏季[20]、塞尔维亚3月份[21]以及德国的春季[22]感染水平较高，不同的地区感染严重的季节不同，造成这一现象的原因尚不明确。

作为全球范围内蜜蜂的主要感染病原之一，N.ceranae具有无症状感染潜伏期的特点，并且地理分布范围急剧扩大，可以跨越物种寄生以及适应不同的气候。本文综述了近10年东方微孢子虫的研究情况，包括N.ceranae的传播途径、对蜜蜂健康的影响、与其他病原的相互作用，旨在帮助广大科研工作者了解N.ceranae，为对N.ceranae的防控提供新思路。

1 东方蜜蜂微孢子虫的传播途径

N.ceranae重要的传播途径是蜜蜂个体与个体以及蜂群与蜂群之间的传播。在已感染微孢子虫的蜂群中，不同个体之间存在交互哺育行为和清理行为，并且患病蜜蜂可能会污染蜂粮和蜂蜜，均可增加个体与个体之间传播的可能性[23]。蜂花粉和蜂蜜等蜂产品也可能被孢子污染，当作为饲料饲喂蜂群的同时也传播了微孢子虫[20]。蜜蜂的飞行排泄行为可能会污染到水源及其他蜜粉源，这也促进了蜂群与蜂群之间的传播[24]。此外，有研究表明，N.ceranae还可以进行垂直传播，Roberts等[25]在雄蜂的精液中检测到微孢子虫，而蜂王则可能通过注入感染了微孢子虫的雄蜂精液进行人工受精，从而感染N.ceranae。但是在自然条件下蜜蜂的幼虫期和蛹期未发现有N.ceranae感染，Eiri等[26]在实验室条件下成功感染了西方蜜蜂幼虫，表明了蜜蜂幼虫也能够被N.ceranae感染。

Fenoy等[27]测定了N.ceranae在不同温度条件下的抗性，发现在60℃和35℃时具有较高的耐热性和耐干燥性，冷冻后的存活率显著下降，在4℃时孢子迅速退化，这表现出N.ceranae强大的生存潜力，也增加了以孢子形式传播的多样性。黄喉蜂虎（Merops apiaster）是一种食蜂鸟，这种鸟主要吃昆虫，特别是蜜蜂和胡蜂，在吃了受感染的采集蜂后，可在其粪便中检测到有活性的孢子[28]，它的迁徙行为也促进了N.ceranae在各地区的传播。蜂农之间的蜂群和蜂王交易也增加了N.ceranae的传播范围；越来越多的商业蜜蜂作为授粉昆虫被应用在大棚作物中[14]，日本每年都会从国外进口大量的授精蜂王，这些原因都增加了N.ceranae的检出率。在中国，转地放蜂的饲养方式也增大了蜂群之间的接触，正常的蜂群很容易通过盗蜂等多种方式造成感染。

2 东方蜜蜂微孢子虫对蜜蜂健康的影响

N.ceranae感染的主要症状包括对糖水的大量消耗[29]、血淋巴海藻糖的加速代谢[30]、抑制免疫反应增加蜜蜂对其他病原体的易感性[31]、蜜蜂死亡率的上升[32]以及加速哺育蜂向采集蜂的过渡[33]。过早的采集觅食和较高的死亡率导致的蜂群内工蜂数量的减少，被认为是蜂群崩溃的主要原因之一[34]。

2.1 东方蜜蜂微孢子虫对蜜蜂免疫系统的影响 昆虫具有强大的免疫系统来抵御微生物和真核病原体的攻击。外骨骼角质层和消化道内壁的包膜是昆虫的第一道防线，它可以阻止病原体进入体腔。作为最重要的一道防线，昆虫的先天免疫通常被分为细胞免疫和体液免疫，如吞噬和包被作用、抗菌肽的分泌等[35]。中肠是蜜蜂重要的器官，在消化吸收、免疫防御和解毒作用方面发挥重要的作用，作为蜜蜂和N.ceranae相互作用的重要场所，当N.ceranae被蜜蜂摄取后，在中肠肠液的刺激下，孢子萌发，通过极丝弹射的方式破坏中肠上皮细胞，并将孢子转移到宿主细胞胞浆内，在细胞内繁殖发展[36]。孢子在中肠内发育成熟后，可能会随粪便排出，亦可能继续感染其他上皮细胞，最终破坏整个中肠上皮细胞层[37]。

蜜蜂基因组分析结果显示，相对于其他独居性昆虫，蜜蜂免疫相关基因的数量只有独居性昆虫的三分之一[38]，然而在自然界中蜜蜂却体现出对一些病原的有效防控，这依赖于蜜蜂的社会 性免疫[39]可以弥补个体免疫的先天不足。Antúnez等[40]通过对蜜蜂个体免疫水平的检测发现，N.ceranae感染后，一些免疫相关基因如abaecin、hymenoptaecin表达显著下调，免疫相关酶、葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase,GLD）和卵黄原蛋白表达水平也明显下调， 表明N.ceranae感染可以抑制蜜蜂的免疫防御机制，随后的大量研究也证明了这一点，如defensin、apidecin、serine protease 40、catalase等[41-42]多个免疫相关基因均下调表达。蜜蜂感染N.ceranae会引起的复杂免疫反应，不仅表现在抗菌肽的下调[43]，还可以抑制Toll和Imd信号通路以及模式识别受体相关基因的表达，且随着感染时间的推移而抑制增强[44]。Schwarz等[45]在对肠道不同部位的分析结果显示中，蜜蜂在感染N.ceranae数小时内就会产生免疫反应，随后会快速增强Toll和Imd信号，并增加细胞识别分子Dscam和defensin 2的表达。这可能是免疫信号通路在不同的组织细胞间存在特异性，表达程度和方式均不同，如defensin 2仅在直肠组织中参与，表明肠道不同区域对寄生虫的免疫具有特定作用。

此外，N.ceranae感染可以抑制细胞信号传导和肠道细胞自我更新相关基因的能力[32,46]和抑制凋亡基因中的IAP家族基因上调[47]。有趣的是，中肠作为N.ceranae与蜜蜂的主要互作部位，被N.ceranae感染后反而会抑制中肠上皮细胞的凋亡[48]，这可能是N.ceranae为了避免宿主产生免疫防御的一种策略。

2.2 东方蜜蜂微孢子虫对蜜蜂新陈代谢的影响 N.ceranae感染的蜜蜂会表现出与行为和生理变化相关的能量压力。在正常蜂群中，抑制脂肪酸合成以及饥饿可以使蜜蜂在生命中更早地开始觅食[49-50]，并且受饥饿胁迫的蜜蜂会改变它们的行为，提高采集出勤率，保证能量供应。Mayack等[30]首次表明，为了应对N.ceranae感染，蜜蜂感染后会增加食物消耗并表现出更强的饥饿程度。这些受感染的工蜂表现出摄入过多的碳水化合物[51]，可能是病原体为促进自身的繁殖与发展，利用宿主的能量代谢，使宿主满足自身能量需求不足，从而产生旺盛的能量代谢活动。也有可能是N.ceranae在蜜蜂中肠的生存策略，通过提高宿主能量代谢需求而减少免疫系统的防御，利于其发展。Li等[52]报道，N.ceranae感染的蜜蜂被检测到脂质的快速流失，表明脂质也可用作由于感染引起的代谢需求增加的能量来源。此外，Vidau等[53]通过对感染后10 d的工蜂中肠进行蛋白质组学研究发现，参与能量供应的4种蛋白MRJP1、MRJP2、MRJP3和α-葡萄糖苷酶Ⅲ在感染N.ceranae的中肠中较少。同样，气相色谱-质谱分析显示，与果糖、L-脯氨酸、山梨醇和甘油等各种生化途径有关的大多数碳水化合物和氨基酸都有所减少。以上的多种新陈代谢的改变可以对下游生理功能造成影响，促进了蜜蜂工蜂的早熟现象，从而加速了蜂群的崩溃。

蜜蜂卵黄原蛋白（Vitellogenin,Vg）是一种雌性特异性蛋白质，大小为180 kDa，由脂肪体合成并释放到血淋巴中，在工蜂发育过程中发挥着重要的作用，如蜂王浆的合成、促进免疫和抗应激，并且被报道与保幼激素（Juvenile hormone,JH）共同调节蜜蜂的行为[54]。幼年成蜂体脂组织Vg转录水平高，血淋巴JH滴度低，而外出采集觅食开始后，老年工蜂Vg转录水平低，JH滴度高[55]。Goblirsch等[8]通过N.ceranae感染实验发现处理组工蜂的Vg转录水平较低，而JH滴度较高。Vg/JH平衡的这种改变被认为是导致感染N.ceranae的工蜂过早出房采集和寿命缩短的原因[8]。有趣的是，Dussaubat等[56]发现，N.ceranae感染可以提高油酸乙酯（ethyl oleate,EO）的水平。EO是蜜蜂工蜂中的一种引物信息素，它用于调节工蜂的行为成熟，即抑制执行巢内任务的哺育蜂向执行觅食任务的采集蜂转变。EO水平的上升可能扰乱蜂群的正常分工，误导蜂群中的实际采集蜂的数量，蜂群社会分工的需求使得哺育蜂过早的转变为采集蜂，增大了蜂群内成蜂的损耗，导致蜂群内蜜蜂大量减少，最终群势衰落，整个蜂群崩溃。

3 东方蜜蜂微孢子虫与其他病原体的相互作用

在宿主内部，仅被一种寄生虫自然感染是罕见的，多重感染比较普遍，不同病原之间对宿主的相互作用可以影响疾病的严重程度和流行病学。

3.1 东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫的相互作用 蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）感染的季节性规律比较明显：夏季感染水平较低，秋天到达低峰，冬季感染数量缓慢上升，春季感染率最高，在潮湿和寒冷的气候条件下出房采集，感染水平将迅速上升[57]。

过去的研究认为N.apis是感染A.melllifera的唯一一种孢子虫，而在2006年后的研究中，人们发现N.ceranae流行的范围越来越大，同时这些地区内的报告中没有N.apis的感染情况，由此推测，N.ceranae已经从原始宿主A.cerana转移到A.mellifera，并有取代N.apis生态位的趋势。然而，通过对历史样本的研究发现，早在1975年美国洛杉矶A.melllifera的工蜂样本就已经有感染N.ceranae的记录，并且同时感染N.ceranae和N.apis，在调查的30个样本中N.ceranae的感染率为80%，N.apis的感染率为73.3%[13]。N.ceranae的全球感染优势也被证明并不是因为孢子增殖能力或者感染性的差异[58]。

Forsgren等[59]利用qPCR技术，研究了两种微孢子虫在宿主间的共同感染竞争关系，实验结果表明，两种微孢子虫在感染剂量和增殖速度上存在微小差异，N.ceranae相对于N.apis并没有在宿主内竞争效应中显示出任何明显的竞争优势。Natsopoulou等[60]的研究也发现当两种病原体同时引入时，没有观察到相互作用，但当N.ceranae是首先感染时，存在优先效应，可显著抑制N.apis的生长。不过目前尚不清楚共同感染情况下，对蜜蜂中微孢子虫的流行病学有何影响。此外，对于N.ceranae是否比N.apis更具致病性，也存在一些争议[22,58-59]，因为这在不同的研究中似乎差别很大，可能这与接种孢子虫的剂量和时间有着重要的关联。

3.2 东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂残翅病病毒的相互作用蜜蜂残翅病病毒（Deformed wing virus,DWV）是蜜蜂中的一种常见病毒，它可以引起成年工蜂翅膀残缺等症状。微孢子虫能够对中肠上皮细胞造成破坏，这可以增加病毒病原体通过肠壁进入血淋巴的机会[61]，也有研究表明N.ceranae可以抑制蜜蜂的免疫反应[41]，从而使受感染的蜜蜂更容易被病毒感染。

Costa等[62]首次报道N.ceranae和DWV在蜜蜂不同身体部位的相互作用，结果发现在中肠中N.ceranae孢子数量和DWV存在负相关性，而在其他组织没有这种关系，表明DWV和N.ceranae可能主要在蜜蜂中肠相互作用，通过竞争宿主细胞或特定细胞功能维持活性。然而，Martin等[63]在夏威夷的调查并没有发现N.ceranae孢子数量和DWV存在任何相关性。在另一项研究中，研究人员在实验室条件下对DWV和N.ceranae共同感染的蜜蜂不同时期进行取样，结果发现在DWV感 染的早期阶段，N.ceranae可以以剂量依赖的方式加速受感染蜜蜂的DWV复制，此外该研究还表明营养对病毒的感染也有着一定影响，饲喂花粉的蜜蜂中N.ceranae对DWV滴度的影响要比只饲喂糖水的蜜蜂要强[64]。前人的研究表明，N.ceranae和DWV的协同作用可能受剂量和营养作用，两种病原菌之间的协同作用可能影响蜜蜂群体的损失。

3.3 东方蜜蜂微孢子虫与农药感染的相互作用 现代农业生产中农药的大量使用，在有效防控害虫的同时，也会对非靶标的授粉昆虫造成一定的危害[65]。蜜蜂作为自然界重要的授粉昆虫，会接触到残留在花朵及空气中的农药残留，增大了蜜蜂与农药接触的概率，农药和N.ceranae的相互作用被认为是导致蜂群死亡率增加的重要原因之一，困此也得到了更多人的关注。

新烟碱类杀虫剂（neonicotinoid insecticides）具有高效、高选择、对哺乳动物低毒的特点而被广泛的应用于农业生产中，已有研究证明其通过对昆虫的神经毒害作用达到效果，亚致死剂量的新烟碱类杀虫剂会对蜜蜂的行为、生理代谢以及免疫系统造成影响[66-67]。微孢子虫与新烟碱类杀虫剂的相互作用会对蜜蜂健康造成显著的影响，同时感染微孢子虫和田间浓度的吡虫啉（Imidacloprid）会增加成年蜜蜂死亡率，并且会使葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）活性显著降低，葡萄糖氧化酶可以对蜂群和蜂粮消毒从而参与社会免疫[68]。此外，杀虫剂胁迫已经感染N.ceranae的蜜蜂，会对N.ceranae的增殖造成影响，Vidau等[69]的感染结果显示，相比只感染N.ceranae的蜜蜂，同时感染氟虫腈（Fipronil）的蜜蜂感染孢子量显著降低，而同时感染噻虫啉（Thiazoline）的蜜蜂感染孢子量显著增强。同样有研究也表明，亚致死剂量的吡虫啉会增加蜜蜂感染孢子量[70]。这种相互作用并不仅限于新烟碱类杀虫剂，有一项调查发现，在采集到的所有花粉样本中，杀菌剂的含量最高，虽然杀菌剂通常被认为对蜜蜂是相当安全的，但在该调查中发现，百菌清（Chlorothalonil）和蜂农用来控制瓦螨感染的杀真菌剂对蜜蜂抵抗寄生虫感染的能力有显著影响[71]。而在另一项研究中，没有发现杀螨剂和N.ceranae同时胁迫会对蜜蜂死亡率以及蜜蜂免疫相关基因有影响，在亚致死剂量的香豆素或 氟胺氰菊酯感染的情况下，N.ceranae在蜜蜂中的孢子含量也没有显著变化[72]。

大量的研究证明，亚致死剂量的农药可以增加N.ceranae对宿主的危害程度，然而针对农药与N.ceranae的相互作用，仍存在很多争论，需要更多的研究来证明蜜蜂在哪种条件下、哪种相互作用会对蜂群的健康受到影响。

4 总结与展望

大量的研究表明N.ceranae地理分布及感染的物种类别呈现多样性，其对蜜蜂的健康如行为、寿命、定向等造成的影响成为研究的热点，研究发现N.ceranae是引起CCD的重要因素之一。然而，其流行规律的不明显、传播途径的多样性均给防治工作带来了困难。到目前为止，从烟曲霉（Aspergillus fumigatus）中分离的烟曲霉素（Fumagillin）是少数已知具有抗微孢子虫活性的药物之一[73]，虽然在实验室条件下效果较好，但在野外条件下紫外线的辐射会加快化合物的降解，并且在欧洲大部分地区使用抗生素进行治疗是不合法的。此外，寄生虫广泛存在于自然界，目前已知的1400种微孢子虫中有8个属14个种被发现能够感染人类[74]，鸟类携带的疟原虫（Plasmodium）、隐孢子虫（Cryptosporidium）可通过迁徙飞翔、笼养等方式传播，对人类健康造成威胁[75]，但关于蜜蜂携带的N.ceranae能否影响人类健康尚不清楚。

N.ceranae感染的蜜蜂，会造成授粉效率降低、早熟觅食和受感染蜜蜂寿命缩短。但在不同的实验中，剂量、环境、时间的影响在宿主中体现出不同的状态，实验室条件下虽然可以尽量避免其他因素的干扰，但蜜蜂作为一种群居的社会性昆虫，其免疫系统和生理代谢体现出复杂的多样性，需要我们充分考虑田间条件的各种影响因子，全面的考量其免疫、代谢、能量应激等与早熟的采集行为之间的联系，以及更好的理解寄生虫-宿主之间的动态关系，以更好地模拟其生存环境。

尽管现在的研究已经揭示了N.ceranae对蜜蜂个体及群体造成的损伤，但有关蜜蜂不同发育时期N.ceranae感染造成的影响却鲜有报道，并且目前普遍认为，单一的影响因素并不是造成蜂群崩溃的主要因素，仍需要我们更好地去探索N.ceranae与其他病原如病毒和农药的相互作用。在研究和评估蜂群健康的同时，应注意N.ceranae孢子数的多少不宜单独作为蜂群健康与否的指标[76]。此外，对于N.ceranae的原始寄主A.cerana的抗性机制以及对N.ceranae的种群遗传结构研究，有助于为微孢子虫的防治提供思路，为蜂群的健康发展提供科学依据，更好的促进蜂产业的发展。