顶复门原虫棒状体蛋白疫苗候选分子的研究进展

孙芸芸，廖申权，李跃龙，吕敏娜，吴彩艳，李 娟，林栩慧，胡俊菁，肖文婉，孙铭飞，张健騑，曹 正，袁伟康，戚南山，顾有方

（1.岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心、茂名分中心，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室，广东省农业科学院动物卫生研究所，广州 510640；2.安徽科技学院动物科技学院，凤阳 233100；3.广东省农产品质量安全中心，广州 510013）

顶复门原虫是一种专一性的胞内寄生性原虫，包括巴贝斯虫（Babesia spp.）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、艾美耳球虫（Eimeria spp.）、隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）及疟原虫（Plasmodium spp.）等，是人和动物的重要病原，可引起人类和动物的多种疾病，不仅危害人类的生命健康，而且给畜牧养殖业造成巨大的经济损失[1-2]。目前对原虫病的主要控制措施仍依赖于化学药物疗法，然而抗寄生虫药物既不能预防人和动物感染疾病，也不能清除感染宿主内的虫体，因此，筛选疫苗候选分子、研制新型有效疫苗迫在眉睫。近年来诸多研究发现，顶端复合器在顶复门原虫入侵宿主细胞过程中发挥重要作用，其中棒状体是顶复合器的重要构件，在虫体入侵宿主细胞时棒状体能够分泌相关蛋白分子，促进纳虫空泡（parsitophorous vacuole,PV）的形成[3]。在已鉴定的主要原虫抗原中，棒状体蛋白被认为是一种最具潜力的候选疫苗[4]，对入侵过程以及宿主细胞的存活都至关重要。本文以棒状体蛋白研究为基础，综述了近年来棒状体蛋白在顶复门原虫疫苗中的研究进展。

1 棒状体蛋白

棒状体是所有顶复门原虫共有的一种独特分泌型细胞器，其外形似棒状，由两个不同的部分：前导管（颈部）和后球茎（基部）组成[5]，由电子致密的嗜锇酸物质（osmiophilic）构成[6]。近年来研究人员利用蛋白质组学和基因组学方法对弓形虫和其他顶复门原虫棒状体的含量进行了识别，结果发现包含38个棒状体蛋白[7]，其中20个蛋白定位于棒状体细胞器：包括9个棒状体颈部蛋白（rhoptry neck proteins,RONs）和11个棒状体基部蛋白（rhoptry proteins,ROPs）。

目前对棒状体蛋白功能的研究中发现，在顶复门原虫入侵宿主细胞的过程中，棒状体蛋白起着关键作用：如一些棒状体颈部蛋白（如RON2、RON4、RON5和RON8等）可与微线分泌的顶膜抗原（apical membrane antigen,AMA）相互作用，在虫体顶端和宿主细胞膜接触部位形成“运动结合体（moving junction,MJ）”，随后包围着虫体缓慢进入宿主细胞，并向后滑动形成纳虫空泡并完成入侵过程。此外，在对弓形虫棒状体蛋白的研究中，Molina等[8]发现，一些ROP蛋白（如ROP5、ROP16和ROP18等）被称为ROP激酶，作为丝氨酸-苏氨酸激酶发挥作用，在寄生虫的毒力和致病性以及宿主细胞调节中发挥关键作用。因此，棒状体蛋白有望成为抗弓形虫等顶复门原虫病的疫苗候选分子，加强对其生物学特性及作用机制的研究将为寄生虫病的防控提供新的思路。

2 棒状体基部蛋白及其在顶复门原虫疫苗中的研究

2.1 棒状体基部蛋白概述 棒状体基部蛋白又称为棒状体蛋白激酶，其为适应不同虫体的不同发育方式而呈现出异质性和保守性差等特点[9]。该类蛋白种类繁多，一般分为ROP1和ROP2蛋白家族，其中ROP1作为穿透增强因子（penetration enhancing factor,PEF）在1966年首次被发现，在虫体入侵过程中起到联系宿主胞膜的作用，是顶复门原虫毒力关键因子[10-11]；ROP2蛋白家族，包括ROP2、ROP3、ROP4、ROP8以及ROP18等5种蛋白，该家族拥有丝氨酸-苏氨酸的激酶活性结构域，在虫体侵入宿主细胞的过程中分泌ROPs，有助于PV的形成，且分泌后能迅速与纳虫空泡膜（parasitophorous vacuole membrane,PVM）结合并参与PVM功能的调节[12-13]。

2.2 棒状体基部蛋白在弓形虫疫苗中的研究 顶复门原虫生活史非常复杂，存在多个抗原表位。目前研究较多的是基于TgROPs的疫苗在不同小鼠模型中的应用。其中DNA疫苗是一种利用质粒载体来转移和表达靶基因的新方法[14]。大量研究结果发现，DNA疫苗可以激发和诱发特定的细胞和体液免疫反应[15]。多数学者通过构建ROP1、ROP2、ROP4、ROP13、ROP17和ROP18等DNA疫苗对幼鼠进行免疫，结果显示幼鼠CD4+T和CD8+细胞比例可明显升高[16]。这些DNA疫苗已成为顶复门原虫疫苗研究的重要疫苗候选分子。

2.2.1 TgROP1 在弓形虫核酸疫苗研制中，基因佐剂已成为增强DNA疫苗保护效能的有效工具。IL-12是控制、限制急性和慢性弓形虫病的关键促炎细胞因子[17]。Quan等[18]将IL-12+pGRA7-ROP1联合应用于BALB/c小鼠可延长其生存时间，其中在接种致死剂量后28 d内，50%小鼠存活，此外，脑组织囊肿的数量明显减少。Parthasarathy等[19]通过对核酸及重组蛋白疫苗进行了对比，将重组的pVAX1-ROP1和纯化的rROP1分别注射到不同的小鼠体中，经免疫印迹分析发现，ROP1是一种免疫原性抗原，可诱导体液免疫应答，并在免疫小鼠血清中检测到目的蛋白条带。不仅如此，接种ROP1抗原后，小鼠对强毒株速殖子的感染具有部分保护作用。这些结果表明，ROP1抗原是开发弓形虫病疫苗的潜在候选抗原。

2.2.2 TgROP2 Leyva等[20]在真核表达载体pcDNA3中克隆ROP2基因，得到pcDNA3-ROP2重组质粒，并将该质粒免疫BLAB/c、C57BL/6和CBA/J小鼠，观察诱发的小鼠免疫反应。通过酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和免疫印迹（Western blot,WB）分析显示，pcDNA3-ROP2重组质粒诱导小鼠产生了细胞免疫应答和体液免疫应答。其中与空白对照组相比，BALB/c小鼠的死亡时间明显延迟。同时还发现该重组质粒免疫的小鼠对刚地弓形虫RH强毒株攻击没有抵抗，而用减毒活疫苗温度敏感株ts-4免疫的小鼠产生保护作用。Vanesa等[21]研究结果表明，混合免疫rROP2+CpG-ODN可引起强烈的体液反应和Th1-biased免疫反应，免疫rROP2+CpG-ODN和rROP2+rGRA4+CpG-ODN的C3H/HeN（H-2k）小鼠在口服20个Me49（Ⅱ型）组织囊肿后， 其脑囊肿负担分别减轻63%和66%。以上研究结果表明，ROP2可以作为预防弓形虫感染的疫苗候选分子。

2.2.3 TgROP4 与ROP2一样，在弓形虫入侵宿主细胞过程中，ROP4参与PV功能的调节，在宿主细胞的黏附、入侵和细胞内的复制等方面有着密切的关系[22]。Dziadek等[23]利用rROP2和rROP4蛋白疫苗免疫C3H/HeJ小鼠，观察其对小鼠免疫效果，结果发现两种抗原均产生了对IgG1特异性抗体的体液反应和混合型Th1/Th2细胞免疫反应，表明其有较好的免疫原性。不仅如此，接种rROP2和rROP4疫苗的弓形虫弱毒株DX株包囊小鼠具有部分保护作用，脑寄生虫负荷显著降低。目前对ROP4疫苗的研究相对较少，但发现ROP4具有调节宿主细胞蛋白质磷酸化的功能，能产生良好的免疫保护作用。

2.2.4 TgROP5 ROP5是弓形虫的主要毒力因子，参与细胞内增殖。该蛋白可显著降低PVM中免疫相关GT-Pases的积累，从而维持PVM的完整性。为评价重组rROP5的保护作用机制，Zheng等[24]以rROP5蛋白对BALB/c小鼠进行三次免疫，首次以100 μg rROP5混匀弗氏完全佐剂进行免疫，二免和三免分别为100 μg rROP5混匀弗氏不完全佐剂。结果发现，与对照组相比，rROP5可以诱导显著的细胞免疫反应和体液免疫反应（Th1/Th2）。此外，用rROP5免疫的小鼠对刚地弓形虫RH株的致命挑战表现出较长的生存时间。可见，rROP5可有效保护小鼠抵抗弓形虫的入侵。

2.2.5 TgROP13 Wang等[25]通过构建pVAX-ROP13和以IL-18为基因佐剂的pVAX-ROP13DNA疫苗，评价TgROP13的免疫原性和免疫保护作用机制。研究结果发现，pVAX-ROP13和pIL-18共免疫使小鼠存活率显著提高。单独使用pVAX-ROP13和抗强毒RH株（Ⅰ型）存活时间分别为32.3±2.7 d、24.9±2.3 d（P＜0.05）。用PRU虫株（Ⅱ型）攻毒后，pVAXROP13和pVAX-ROP13+pVAX-IL-18免疫小鼠脑囊肿负荷降低率分别为39.82%和66.03%。这表明以IL-18为基因佐剂的ROP13 DNA疫苗可以引发对寄生虫的强烈体液和细胞反应，被认为是一种潜在的有效候选疫苗。

2.2.6 TgROP17 许多研究结果表明，特异性分泌免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A,SIgA）在粘膜表面起着关键作用，是防御弓形虫等多种粘膜组织感染的第一道防线[26]。Wang等[27]将RH株弓形虫ROP17在细菌中与谷胱甘肽s转移酶（Glutathione-S-transferase,GST）融合表达，采用rTgROP17对BALB/c小鼠进行滴鼻免疫，研究其对慢性和急性弓形虫感染的免疫应答和保护作用。结果表明，经过rTgROP17免疫的小鼠产生了高水平的特异性抗rTgROP17 IgGs，增加系统性免疫反应有关Th1（IFN-c、IL-2）和Th2（IL-4）的含量，且增强rTgROP17免疫小鼠淋巴细胞增殖（刺激指数SI）。在这些小鼠的鼻腔和肠道冲洗液中也观察到鼻粘膜免疫反应增强，TgROP17促使特异性分泌型IgA（SIgA）分泌增加。与对照组相比，接种疫苗的小鼠肝脏和大脑寄生虫负担较低，分别为59.17%和49.08%，对慢性RH感染表现出明显的保护作用。接种疫苗的小鼠对致命的RH毒株感染也表现出明显的保护作用，其存活率增加了50%。

2.2.7 TgROP18 ROP18作为弓形虫的主要毒力因子，参与控制寄生虫的细胞内增殖[28]。Yuan等[29]研究结果表明该蛋白是一种具有前景的候选疫苗，用质粒构建的pVAX-ROP18在昆明小鼠肌肉内免疫可引起特异性体液反应，促进淋巴细胞增殖，并增加了CD4+和CD8+T细胞的活化。与对照组相比，接种1×103株RH株速殖子后，pVAX-ROP18的存活时间（27.9±15.1 d，P＜0.05）明显延长。Rashid等[30]采用rTgROP18对BALB/c小鼠进行滴鼻免疫，结果显示，有抗ROP18 IgG1抗体产生并发生混合的系统性Th1/Th2型细胞免疫应答，其特征在于产生了IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-5，但是鼻粘膜免疫反应较弱。因此，鼻内免疫rROP18可以强烈地激发全身免疫应答和粘膜免疫应答，对攻虫小鼠起到免疫保护作用。

2.2.8 TgROP19 随着生物信息学被广泛应用，表位预测成为免疫原性设计和逆转疫苗学中不可或缺的工具[31]。对ROP候选疫苗进行数据库检索，利用生物信息学分析潜在的B细胞表位和T细胞表位，从而引入新的弓形虫候选疫苗。Zhou等[32]通过对ROP19和SAG1的抗原特性进行分析比较，发现ROP19在抗原指数和表面概率上均优于SAG1，与SAG1相比，ROP19具有良好的线性B细胞表位。此外，还预测了与ROP19的MHCⅡ类分子结合的多肽的50%抑制浓度（IC50）值，并估算了ROP19的较低的IC50值，表明ROP19具有活的T细胞表位，将来可能成为防控弓形虫病的潜在DNA疫苗候选分子。

2.3 棒状体蛋白在其他顶复门原虫疫苗中的研究 在隐孢子虫棒状体蛋白的研究中，Huang等[33]通过蛋白质组技术分离获得22种潜在的棒状体蛋白，并鉴定出与刚地弓形虫和犬新孢子虫棒状体蛋白同源的蛋白，以及一些结构域类似于刚地弓形虫棒状体蛋白的蛋白，同时证实了这22种候选的棒状体蛋白可作为研究寄生虫入侵途径和致病机制的靶点，在抵抗隐孢子虫病的感染中发挥重要作用。

在绵羊巴贝斯虫的研究中，Niu等[34]通过构建RAP-1a重组抗原，经ELISA和Western blot结果显示，该抗原与被其他病原体感染的动物血清间没有交叉反应，对RAP-1a的高水平抗体滴度一直持续到感染后10周，可见羊巴贝斯虫RAP-1a的重组抗原在寄生虫入侵过程中发挥重要的作用，是抵抗巴贝斯虫病感染的重要候 选疫苗和诊断抗原。Collins等[35]通过亚马逊松鼠猴对恶性疟原虫棒状体蛋白RAP1和RAP2进行疫苗试验，比较寄生虫源（PfRAP 1和2）和重组蛋白（rRAP1和2）诱导保护性免疫反应的效果。结果表明，含有疟原虫棒状体相关蛋白RAP1和RAP2的疫苗对亚马逊松鼠猴的疗效有着明显效果，并证实了ROP1和ROP2是恶性疟原虫的潜在候选疫苗。这些研究结果将为下一步抗疟疾疫苗的研制提供数据，打下理论基础。

3 棒状体颈部蛋白及其在顶复门原虫疫苗中的研究

3.1 棒状体颈部蛋白 研究人员在1980年首次发现并鉴定了疟原虫棒状体颈部蛋白，该蛋白由此被广泛关注[36]。目前，对棒状体颈部蛋白的研究仍然较少，普遍认为其是一类比棒状体基部蛋白更保守的蛋白[37]。在对艾美耳球虫棒状体细胞器的研究中，研究人员利用蛋白质组技术分离获得一组新的棒状体蛋白，由于这些蛋白位于棒状体的颈部被命名为棒状体颈部蛋白，主要包括RON1-8等8种棒状体颈部蛋白，这些蛋白通常被注释为药物治疗或免疫预防的靶标分子[38]。在顶复门原虫棒状体颈部蛋白的功能研究中发现，RON2被认为在虫体入侵宿主细胞过程中起着最关键的作用：当虫体子孢子或速殖子黏附至宿主细胞时，虫体会迅速分泌RON2，插入宿主细胞膜表面，与宿主细胞相应受体作用，同时与RON4、RON5和RON8蛋白，以及微线分泌的顶膜抗原AMA1发生特异性结合，在宿主表面形成环状的MJ，虫体通过“MJ”在数秒或数十秒内入侵至宿主细胞内发育繁殖[39]。因此，棒状体颈部蛋白在细胞中可驱动寄生虫的移动连接，在结构功能上将虫体与宿主细胞串联起来，对于虫体入侵至关重要。

3.2 棒状体颈部蛋白在顶复门原虫疫苗中的研究 近年来，人们对顶复门原虫入侵宿主细胞机制有了大量的研究，发现RONs是关键毒力因子，对虫体入侵宿主细胞起着关键作用，可作为潜在的疫苗候选分子。

3.2.1 RON2 RON2蛋白是一类重要的入侵相关蛋白，Delgadillo等[40]研究表明，在顶复门不同属种的原虫基因组数据库中均存在RON2的同源编码基因，蛋白结构保守，由1段信号肽、3段跨膜结构及4段功能结构域组成。戚南山等[41]利用生物信息学技术对E.tenella中存在TgRON2的同源蛋白棒状体颈部蛋白2（E.tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2）的基因序列进行分析，结果显示EtRON2与其他原虫棒状体蛋白的氨基酸序列具有一定的相似性，与TgRON2的进化关系最为接近，说明EtRON2在入侵宿主细胞过程中起着关键作用。王晔等[42]构建EtRON2基因的重组真核表达质粒pCAGGs-EtRON2鉴定EtRON2基因的表达情况。研究结果发现，IFA显示转染的293T细胞中检测到特异性红色荧光，Western blot结果分析具有良好的抗原性。在间日疟原虫的研究中，Arevalo-Pinzon等[43]首次鉴定了PvRON2，PvRON2是由单个6615 bp外显子编码的2204个残基长蛋白，该外显子包含对氨基末端的疏水信号序列、对羧基末端的跨膜结构域和两个螺旋卷曲的α-螺旋基序，与其他几种疟疾候选疫苗的特征类似。在弓形虫的研究中发现，虫体接触宿主细胞后会分泌RON2蛋白，其氨基端两段结构域与RON4、5、8形成复合物插入宿主细胞膜内，与宿主受体互作[44]，羧基端两段结构域暴露在宿主细胞膜外，与微线分泌的顶膜抗原AMA结合，从而形成由RON2、4、5、8及AMA共同组成的蛋白复合物“运动结合体”，介导虫体对宿主细胞的入侵[45]。综上所述，RON2参与了虫体对宿主细胞的入侵，为最具潜力的棒状体颈部蛋白候选疫苗分子。

3.2.2 RON4 Alexander等[46]在疟原虫的研究中发现TgRON4的疟原虫同源物可与顶膜抗原1（plasmodium falciparum apical membrane antigen 1,PfAMA1）免疫共沉淀，最后鉴定为PfRON4。其功能是在虫体入侵宿主细胞过程中与PfAMA1发生特异性结合，并形成复合体在移动连接体处迁移，该发现表明PfRON4蛋白对于虫体入侵宿主细胞过程中起着重要的作用。Rashid等[47]通过对小鼠接种RON4的DNA疫苗和RON4重组蛋白，进行动物免疫保护性实验，观察其抗弓形虫感染的保护效果，结果显示两者均产生了IgG1特异性抗体以及混合型的Th1/Th2的细胞免疫应答，同时，IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-10等细胞因子均显著增加，但是小鼠抵抗慢性弓形虫病的能力较弱。

3.2.3 RON5 在弓形虫和疟原虫的研究中都表明RON5是MJ的成员蛋白之一[48]，在宿主细胞和虫体之间起着连接作用，是寄生虫入侵必需的关键蛋白。Zhao等[49]构建了RON5蛋白真核表达的重组质粒pVAX5-RON5p，并免疫BALB/c小鼠，观察其对弓形虫急慢性感染的保护作用。结果发现pVAX5-RON5p免疫可引起小鼠体液免疫应答和细胞免疫应答，并且免疫组小鼠急性弓形虫感染后生存时间比对照组略有延长。对于慢性弓形虫感染，pVAX5-RON5p免疫小鼠的脑组织囊肿数比空白对照组减少25.8%。可见，RON5 DNA疫苗可以针对急性和慢性弓形虫感染诱导部分免疫保护性。

3.2.4 RON8 Besteiro等[50]利用生物化学方法，确定RON8是MJ复合物的一个新成员，与TgAMA-1和RON2、4、5共同形成MJ，所有的MJ蛋白在被转运到各自的细胞器的过程中都经历了蛋白水解的成熟过程，并且在体外以不成熟的形式结合。通过质谱技术（mass spectrum,MS）分析发现RON8有2979个氨基酸，理论分子量为329 kDa。此外，在弓形虫、新孢子虫和艾美耳球虫中都可以发现RON8，但在疟原虫中暂未发现其同源序列[51]。Straub等[52]通过缺失弓形虫RON8蛋白编码基因，首次对MJ/RON蛋白进行功能分析，结果发现，缺失RON8的虫体在对宿主细胞的附着和入侵方面都受到严重损害，这表明RON8能够使寄生虫在宿主细胞上建立牢固的结合，并进行入侵。另外，缺陷Δron8虫体在入侵宿主细胞时，MJ复合物会出现紊乱的现象。因此，推测RON8在弓形虫入侵宿主细胞以及MJ复合物形成的过程中发挥着重要作用。

3.2.5 RON9和RON10 目前有研究表明，刚地弓形虫的两个新棒状体颈部蛋白：RON9和RON10，它们之间可形成一个高分子量复合物。与其他RON蛋白相比，这种复合物在入侵宿主细胞期间没有在MJ中检测到，可见，RON9和RON10与MJ复合物的形成无关。学者通过敲除RON9实验，发现RON10在棒状体内发生错位定位；若敲除RON10，则会影响RON9蛋白分泌到棒状体，这表明RON9/RON10复合物的形成是相互作用的结果[53]。此外，还发现RON9/RON10复合物的缺失对棒状体的形态、虫体对宿主细胞的入侵和生长以及虫体自身毒力都无显著影响。但在球虫和隐孢子虫中，该复合物的缺失与虫体在肠上皮细胞内的发育有一定的关系。

4 展望

目前，顶复门原虫侵入宿主细胞的详细机制尚不明晰。随着分子生物学、生物信息学和蛋白质组学技术的快速发展，在分子水平上对棒状体蛋白入侵过程的作用机制和功能的研究将逐渐深入。下一步可重点研究在虫体入侵宿主细胞过程中，棒状体蛋白的分泌及其与宿主细胞受体相互作用等的详细机制及信号通路等。相信随着棒状体蛋白特性和功能的深入研究，顶复门原虫入侵、致病机制将逐渐明了，这也为防控该类原虫病疫苗及药物的研发提供有效的信息，为更好防控原虫病提供新的思路。