不同物候期“密叶金毛”化橘红HPLC指纹图谱的建立1

周英彪，陈塬星，李梅菁，庞艺明

(1.广东石油化工学院 生物与食品工程学院，广东 茂名 525000；2.化州天橘化橘红有机生物制品有限公司，广东 化州 525100)

化橘红是芸香科柑橘属植物广东化州柚未成熟或近成熟的外层果皮或全果经加工制成的名贵中药材，具有化痰、理气、健胃消食的作用，临床用于治疗风寒咳嗽、喉痒痰多、食积酒伤等症，有“南方人参”之称，是“中国四大南药”和“十大广药”之一[1,2]。

广东化州市的化橘红种质资源经过漫长人工栽培，已选育出不少性能优良的栽培品种，其中“密叶金毛”是从传统正毛化橘红植株的变异枝条，进行无性繁殖得到的新品种(品系)，目前已有一些企业在种植，种植期间其产量及药效表现良好，值得进行规模化推广种植[3]。但目前对“密叶金毛”这个有优良潜能化橘红新品种(品系)的性状、物候和生理等的研究报道较少。

指纹图谱技术已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的有效手段，可实现对中药内在质量的综合评价和整体物质的全面控制[4]。化橘红的指纹图谱主要有基于遗传物质分析的DNA指纹图谱及基于代谢产物分析的化学指纹图谱[5]。其化学指纹图谱可运用红外色谱、气相色谱及液相色谱等色谱技术建立[6-8]。其中，高效液相色谱(HPLC)指纹图谱具有分离效能高、分析速度快等优点，为国内外广泛接受。

化橘红含有多糖、黄酮、香豆素及金属微量元素等成分，其中黄酮类和香豆素类成分的HPLC分析常用于构建化橘红的化学指纹图谱[9]。基于HPLC的指纹图谱技术在化橘红不同栽培品种选育及其栽培过程管理中，具有良好的应用前景及重要的指导意义[10,11]。因此，本研究中，拟对化橘红“密叶金毛”一年生产周期中，各个物候期样本中香豆素类物质进行HPLC检测分析，建立化橘红“密叶金毛”的花蕾、盛花、幼果及成果的HPLC 指纹图谱。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植株的花蕾、盛花、幼果及成果样本，采自广东化州天橘化橘红有机生物制品有限公司化橘红种植基地；标准品羟甲香豆素、欧前胡素、异欧前胡素与呋喃香豆素(均为色谱纯，中国药品生物制品检定所)；标准品香豆素、7-甲氧基香豆素、6-甲基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素与香柠檬亭(均为色谱纯，美国 Sigma 公司)；标准品佛手内酯(色谱纯，上海友思生物技术有限公司)；甲醇和乙腈(色谱纯，德国Merck公司)。

1.2 仪器与设备

电子分析天平(BP211D型，德国Sartorius公司)；高效液相色谱仪(1100型，美国Agilent公司)配Agilent化学工作站、DAD检测器与自动进样器；反相色谱柱(Nucleosil C18，德国Macherey-Nagel公司)。

1.3 方法

1)样品的采集和处理。按照中药指纹图谱的绘制方法，样品的采集需要10个点以上的原则，采集广东化州天橘化橘红有机生物制品有限公司化橘红种植基地内，10株化橘红“密叶金毛”一年生产周期内的花蕾、盛花、幼果及成果样本。各种样本在65 ℃条件下烘干打成粉，60%以上过60目筛， 其余颗粒以直径不大于1 mm为宜，在65 ℃烘至质量恒定；各种样本分别称0.200 g置于25 mL容量瓶中，加30%的乙醇10 mL浸泡过夜，超声波提取20 min，停止10 min，再超声波提取20 min后，甲醇定容，静止后取上清液经0.5 μm的微孔膜过滤，进样进行HPLC检测[2,12]。

2)HPLC分析条件。样品上高效液相色谱仪(配Agilent化学工作站、DAD检测器与自动进样器)分析，色谱柱为Nucleosil C18(150 mm×4.6 mm×3 μm)。流动相A为水、B为甲醇、C为乙腈，三元梯度洗脱，起始流量0.3 mL/min。梯度洗脱顺序：流动相(50% B +15% C)，流量0.3 mL/min，保持15 min；流动相(50% B+ 20% C)，流量0.4 mL/min，保持2 min；流动相(50% B+30% C)，流量0.6 mL/min，保持0.5 min；流动相(50% B+30% C)，流量0.8 mL/min，保持4.5 min；流动相(50% B+45% C)，流量1 mL/min，保持2 min；流动相(50% B+50% C)，流量1 mL/min，保持3 min；流动相(50% B+50% C)，流量0.8 mL/min，保持3 min；流动相(50% B + 30% C)，流量0.6 mL/min，保持2 min；流动相(50% B+15% C)，流量0.3 mL/min，保持3 min。检测波长315 nm，柱温35 ℃[2, 12]。进样量20 μL。

3)香豆素类物质标准品的HPLC分析。以甲醇为溶剂配制10种香豆素类物质标准品的混合溶液，混合溶液中羟甲香豆素、香豆素、7-甲氧基香豆素、呋喃香豆素、6-甲基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素、佛手内酯、欧前胡素、异欧前胡素以及香柠檬亭的质量浓度分别为10.200，10.000，5.200，9.600，15.000，10.000，5.000，10.000，8.000，9.800 μg/mL[2, 12]。然后按2)中HPLC分析条件，上HPLC进行分析。

4)不同物候期样本的HPLC检测与指纹图谱的建立、分析。10株化橘红“密叶金毛”一年生产周期内的花蕾、盛花、幼果及成果样本，经1)方法处理后，按2)中的HPLC分析条件，上HPLC进行分析。应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统的操作规范》，分析不同物候期特征指纹图谱并绘制HPLC指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 香豆素类物质标准品的HPLC分析

图1为10种香豆素类物质标准品的HPLC色谱分析图。按保留时间的先后顺序依次为羟甲香豆素(7.541 min)、香豆素(8.808 min)、7-甲氧基香豆素(9.803 min)、呋喃香豆素(10.908 min)、6-甲基香豆素(11.617 min)、5, 7-二甲氧基香豆素(13.416 min)、佛手内酯(14.291 min)、欧前胡素(20.916 min)、异欧前胡素(22.675 min)和香柠檬亭(26.716 min)。图1中峰形表明，10种香豆素类物质标准品得到良好分离，表明本研究的HPLC色谱条件能对香豆素类物质实现有效分析，可用于后续的指纹图谱建立研究。

图1 10种香豆素类物质混合标准品的HPLC分析

2.2 花蕾指纹图谱

对S1植株(图2)以及其他9株植株花蕾样本中的香豆素类物质进行HPLC分析，并应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对10株植株的花蕾样本的HPLC图进行比较，绘制得到化橘红“密叶金毛”花蕾的HPLC指纹图谱(图3)。由图3可知，化橘红“密叶金毛”花蕾的HPLC指纹图谱有9个共有峰，表明其中至少含有9种香豆素类物质；与图1进行比较，可以确定其中3种分别为香豆素(图3峰2)、呋喃香豆素(图3峰3)和异欧前胡素(图3峰8)。 对化橘红“密叶金毛”花蕾的HPLC指纹图谱(图3)的9个共有峰的保留时间进行分析，发现9个共有峰的保留时间标准相对偏差均小于0.5%(表1)；而且S2—S9花蕾的HPLC图谱分别与S1花蕾图谱比较，相似度均大于0.900；上述两点表明，基于10株化橘红“密叶金毛”花蕾样本中香豆素类物质分析后所建立的花蕾HPLC指纹图谱，符合指纹图谱要求。

表1 花蕾期指纹图谱9个共有峰的保留时间标准相对偏差分析共有峰序号10株化橘红“密叶金毛”花蕾样品HPLC分析的共有峰保留时间/minS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10标准相对偏差/%18.1478.1488.1468.1458.1508.1518.1478.1468.1488.1470.17528.7968.8018.7978.8018.7968.7968.7968.7958.8018.7960.233310.87910.88110.87510.87310.87810.87910.87910.87810.87810.8790.216412.65912.65912.65912.66112.65812.65712.65612.65712.65512.6570.166514.38614.38514.39114.38514.38714.38814.38614.38614.38614.3870.168616.14216.14216.14416.13916.14416.14316.14216.14516.14516.1420.172722.23822.23822.24122.23822.23722.23622.23622.24122.24122.2380.185822.67522.67622.67522.67522.67522.67622.67822.67622.67522.6780.115926.23326.23426.23426.23326.23426.23526.23426.23526.23326.2330.075图2 S1植株花蕾的香豆素类物质HPLC分析图3 化橘红“密叶金毛”花蕾HPLC指纹图谱

2.3 盛花指纹图谱

对S1植株(图4)以及其他9株植株的盛花样本中香豆素类物质进行HPLC分析，并应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对10株植株的盛花样本的HPLC图进行比较，绘制得到化橘红“密叶金毛”盛花的HPLC指纹图谱(图5)。由图5可看出，其盛花的HPLC指纹图谱有10个共有峰，表明化橘红“密叶金毛”盛花中至少含有10种香豆素类物质；对照图1，可以确定其中4种为香豆素(图5峰2)、呋喃香豆素(图5峰3)、异欧前胡素(图5峰8)和香柠檬亭(图5峰10)。

对化橘红“密叶金毛”盛花的HPLC指纹图谱(图5)的10个共有峰的保留时间进行分析，发现10个共有峰的保留时间标准相对偏差均小于0.5%(表2)；而且S2—S9盛花的HPLC分析图分别与S1盛花分析图比较，相似度均大于0.900；上述两点表明，基于10株化橘红“密叶金毛”盛花样本中香豆素类物质分析后所建立的盛花HPLC指纹图谱，符合指纹图谱要求。

表2 盛花期指纹图谱10个共有峰的保留时间标准相对偏差分析共有峰序号10株化橘红“密叶金毛”盛花样品HPLC分析的共有峰保留时间/minS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10标准相对偏差/%18.1478.1468.1488.1478.1488.1488.1478.1498.1488.1480.08028.7968.7968.7968.8018.7958.7958.7958.7968.8018.7970.218310.87910.87910.87710.87910.87910.87810.87910.87810.87810.8790.067412.65912.65912.65812.65712.65812.65912.65812.65812.65912.6590.066514.38614.38614.38614.38514.38814.38614.38514.38414.38614.3870.104616.14216.14316.14416.14216.14316.14316.14216.14216.14516.1420.098722.23822.23822.23922.23522.23722.23822.23622.23622.23822.2380.119822.67522.67622.67622.67322.67522.67622.67522.67622.67822.6750.120926.23326.23326.23326.23226.23526.23326.23326.23426.23326.2350.0921026.71626.71726.71826.71726.71626.71626.71526.71726.71726.7160.081图4 S1植株盛花样本的香豆素类物质HPLC分析图5 化橘红“密叶金毛”盛花的HPLC指纹图谱

2.4 幼果指纹图谱

类似地，分析了S1植株(图6)以及其他9株植株幼果样本中香豆素类物质，并绘制得到化橘红“密叶金毛”幼果的HPLC指纹图谱(图7)。由图7可看出，其幼果的HPLC指纹图谱有14个共有峰，表明化橘红“密叶金毛”幼果中至少含有14种香豆素类物质；对照图1，可以确定其中4种为香豆素(图7峰2)、呋喃香豆素(图7峰3)、异欧前胡素(图7峰11)和香柠檬亭(图7峰14)。

化橘红“密叶金毛”幼果HPLC指纹图谱(图7)的14个共有峰的保留时间标准相对偏差分析均小于0.5%(表3)；S2—S9幼果的HPLC分析图分别与S1幼果分析图比较，相似度均大于0.900；表明基于10株化橘红“密叶金毛”幼果样本中香豆素类物质分析所建立的幼果HPLC指纹图谱，符合指纹图谱要求。

表3 幼果期指纹图谱14个共有峰的保留时间标准相对偏差分析共有峰序号10株化橘红“密叶金毛”幼果样品HPLC分析的共有峰保留时间/minS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10标准相对偏差/%18.1468.1478.1468.1488.1478.1488.1478.1498.1488.1470.09028.7948.7968.7978.7968.7948.7958.7978.7978.7978.7970.118310.87910.88110.87910.87610.87810.87910.87910.87810.87910.8790.119412.65812.65812.65912.65812.65812.65712.65612.65712.65812.6580.078514.38914.38914.38914.38814.38914.38614.38714.38714.38814.3890.104616.14216.14316.14216.14216.14516.14616.14216.14316.14516.1420.147717.94517.94517.94517.94617.94817.94717.94517.94317.94517.9450.128819.10819.10819.10719.10819.10819.10719.10619.10519.10619.1070.100921.70321.70321.70521.70821.70321.70321.70221.70421.70321.7010.1801022.23822.23822.23722.23822.23622.23522.23922.24122.23822.2380.1541122.67522.67622.67622.67522.67722.67722.68122.67522.67522.6740.1871225.68425.68225.68325.68425.68525.68425.68525.68525.68425.6840.0891326.23326.23526.23426.23326.23526.23226.23126.23326.23326.2350.1281426.71626.71726.71826.71626.71626.71626.71526.71426.71526.7160.104图6 S1植株幼果样本的香豆素类物质HPLC分析图7 化橘红“密叶金毛”幼果的HPLC指纹图谱

2.5 成果指纹图谱

类似地，分析了S1植株(图8)以及其他9株植株成果样本中香豆素类物质，并绘制得到化橘红“密叶金毛”成果的HPLC指纹图谱(图9)。由图9可发现，其成果的HPLC指纹图谱有17个共有峰，表明化橘红“密叶金毛”成果中至少含有17种香豆素类物质；对照图1，可以确定其中4种为香豆素(图9峰2)、呋喃香豆素(图9峰3)、异欧前胡素(图7峰12)和香柠檬亭(图7峰17)。

表4 成果期指纹图谱17个共有峰的保留时间标准相对偏差分析共有峰序号10株化橘红“密叶金毛”成果样品HPLC分析的共有峰保留时间/minS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10标准相对偏差/%18.1468.1488.1528.1498.1538.1508.1548.1488.1518.1490.23728.7948.8028.7958.8038.7958.7948.7968.7948.8028.8010.367310.87910.8810.87610.87310.87910.87310.88310.88210.88210.8780.338412.65812.6612.65812.6612.65912.65612.65412.65812.65412.6580.206514.38914.38614.39214.38214.3914.38714.38614.38814.38714.3860.257616.14216.14416.14516.13816.14616.14516.14716.14816.14216.1470.287717.43617.43817.43617.44117.43917.44017.43817.43617.43917.4350.188817.94517.94317.94617.94817.95017.94817.94917.94617.94717.9460.194919.10819.11019.10619.11219.10619.10819.11219.11519.11219.1080.2831021.70321.70521.70621.70821.69521.69521.70621.70021.70621.7080.4661122.23822.23622.24222.23622.23822.23422.24622.24322.24522.2340.42421222.67522.67522.67222.67422.67622.67822.6822.67822.6822.6820.2971323.16723.16523.16823.15923.16423.16623.16523.16923.16423.1650.2601423.84223.84023.83823.84623.83823.84823.83623.8423.84223.8460.3771525.68425.68025.68225.68225.68625.68725.67825.67525.67925.6820.3471626.23326.23326.23226.2326.23726.23426.23826.23826.23526.2380.2711726.71626.71826.72026.72326.71226.71526.71626.71826.71626.7150.288图8 S1植株成果样本的香豆素类物质HPLC分析图9 化橘红“密叶金毛”成果的HPLC指纹图谱

化橘红“密叶金毛”成果HPLC指纹图谱(图9)的17个共有峰的保留时间标准相对偏差分析均小于0.5%(表4)；S2—S9成果的HPLC分析图分别与S1成果分析图比较，相似度均大于0.900；表明基于10株化橘红“密叶金毛”成果样本中香豆素类物质分析所建立的成果HPLC指纹图谱，符合指纹图谱要求。

3 结论

本研究基于HPLC技术，对化橘红“密叶金毛”花蕾、盛花、幼果与成果等物候期样本中香豆素类化学物进行了分析，建立了化橘红“密叶金毛”花蕾、盛花、幼果与成果等物候期的指纹图谱。所建立的各个指纹图谱共有峰的保留时间标准相对偏差均小于0.5%，且10个样品间的HPLC分析图比较相似度均大于0.900，均符合指纹图谱要求。而且发现，化橘红“密叶金毛”花蕾、盛花、幼果与成果中的香豆素类化学物的种类与含量呈有规律的动态变化，因此所建立的化橘红“密叶金毛”HPLC指纹图谱，可以应用于化橘红“密叶金毛”栽培种植过程中进行质量监测，以保障化橘红“密叶金毛”的栽培种植质量。