次氯酸钠消毒剂在环境微生物消杀方面的应用

李志钢

（帝森福德（北京）国际环境科技有限公司，北京 100020）

如今，消费者更加意识到营养与健康之间的关系，消费者通常认为健康的食品是水果和蔬菜。食品加工商和零售企业都预测到了这一市场趋势，提供范围广泛的包装鲜切蔬菜，并将这些产品定位为结合“健康”和“便利”的绝佳替代品。与此同时，鲜切产品的销售数据也大幅增长。鲜切农产品销售，尽管卷心菜和莴苣因其高机械和生理脆弱性而难以加工，但它广泛存在于水果沙拉中。由于它在进入加工链的那一刻就已经受到微生物的严重污染，一些加工程序（例如切碎）甚至会增加微生物总数。尽管在鲜切蔬菜回收的微生物是造成蔬菜腐烂的主要原因，但受到单核细胞增生等病原体的污染，依然会对消费者身心健康带来风险。减少病原体存在或延长鲜切产品保质期的潜在策略之一是在加工过程中实施去污和消毒步骤。

除了实现微生物减少外，在评估净化过程的充分性时，还应考虑对其他质量属性（如感官质量和营养成分）的影响。一般来说，外观是消费者在决定接受包装的叶类蔬菜时评估的最重要的属性。与鲜切卷心菜和莴苣相关的最常见的质量问题之一是切边褐变。鲜切生菜制备过程中的切口会导致苯丙烷代谢酶的合成、酚类化合物的合成和积累，导致褐变的出现。据说去污剂（例如二氧化氯）具有氧化特性，可以诱导褐变，具有与酶促褐变相同的模式特征。

由于维生素C 和E 等维生素以及类胡萝卜素和酚类物质等次生代谢物的存在，水果和蔬菜，尤其是莴苣对健康有益，水果和蔬菜的摄入量与预防动脉粥样硬化、癌症、糖尿病和关节炎等疾病之间存在正相关关系。

1 消杀方案

关于去污对初加工卷心莴苣营养成分的影响，有研究表明：臭氧水和氯对生菜维生素C 含量的影响受储存时间的影响比洗涤的影响更大。虽然一些研究包括去污对莴苣的营养价值的影响，大多数集中在微生物和感官品质上。本研究的目的是评估除水洗外，使用不同浓度水平下的次氯酸钠对降低微生物负荷的能力。

卷心莴苣购自当地批发企业，在30min 内被运送到实验室。到达后，生菜通过去除外叶和内核并用锋利的刀将其切成1cm 的丝进行人工加工。由于实际限制，使用在不同时间购买的不同生菜头来测试不同的去污剂。因此，为了研究特定消毒剂对特定参数的影响，每个实验都包括一个对照系列（未洗过的生菜）和用水洗过的生菜系列。将大量100g 卷心莴苣在1L 消毒剂溶液中在 16～18℃下在轨道摇床上连续搅拌处理5min。在次氯酸钠处理之前用16～18℃自来水进行1min的洗涤，再在1min 内通过手动厨房离心机去除过量的自来水或消毒剂溶液。

（1）用不同的消毒剂溶液处理农产品，液体试剂在2种浓度下进行了测试，从实用的角度来看，最低浓度更为重要；最高值用于评估其对营养成分的影响是否与浓度有关。对照组对应于未清洗的鲜切卷心莴苣。用饮用水冲洗切好作为参考处理。从次氯酸钠水溶液开始，在酸性环境中进行碘量滴定后，制备具有适当浓度的溶液。最后，用盐酸将pH值调节到6.00。每天通过碘量滴定法测定次氯酸钠溶液的浓度。

（2）利用气态二氧化氯处理微加工卷心莴苣以及测定液相和气相中的二氧化氯浓度。在专门设计的处理室中用气态二氧化氯处理2kg 鲜切卷心莴苣。从1000mg/L 二氧化氯溶液开始，在30s 内通过空气鼓泡将二氧化氯气体从溶液中提取，然后通过管道将气体通入机柜。此外，在室温和1.0%的相对湿度下，莴苣与气体接触9.5min。定期从处理室中抽取气体样本，用以监测处理过程中二氧化氯气体浓度的变化。处理完成后，打开柜门取样分析，二氧化氯气体浓度的测定采用碘量滴定法。

（3）无菌环境取出30g 卷心莴苣样品并转移到无菌袋中，用生理盐水溶液，在30℃孵育3 天后，对菌落形成单位进行计数和感官分析，以确定产品之间是否存在由于应用去污处理而导致的感官质量差异。在60min 内，在4℃下处理样品并将其转移到塑料封闭容器中，在独立的房间进行感官评估。对于每个测试，3 个编码样本（其中1 个与其他2 个样本不同）呈给18 名训练有素的小组成员，并且随机呈现相同数量的可能组合。每个小组成员必须评估样品的整体感官质量，选出最差的样品，并给出选定样本的原因。

（4）颜色测量作为感官分析的客观测量进行。通过在Spectra Magix 软件上运行并在便携式分光光度计进行颜色测量。1 个2cm 深的塑料培养皿中完全装满了卷心莴苣，以防止下面桌面的颜色干扰。关闭培养皿，通过将仪器观察口放在盖子上进行测量。为了排除可变的覆盖表面条件，在颜色测量中包含了镜面干涉。在一个培养皿上随机进行10 次测量。

分析期间的所有玻璃制品都被保护免受日光照射。均质化后，在烧杯中分析称量10g 生菜。加入3 滴消泡剂和50mL 萃取缓冲液后，混合均匀并定量转移至100mL 容量瓶。然后，用萃取缓冲液将烧瓶的内容物稀释至100mL。在折叠过滤器上过滤后，将10mL 滤液放入含有200mg 酸洗活性炭的试管中。在30s 内剧烈摇动试管并在6000g 下离心11min。再次过滤上清液，用蒸馏水稀释至25mL。通过过滤器过滤后，将5mL 转移到10mL 烧瓶中。随后，加入1mL邻苯二胺并用流动水进一步稀释至烧瓶的体积。在此过程中，使用了外部校准。将10mL 稀释溶液添加到200mg 酸洗活性炭中。随后，如前所述遵循该程序。为制备校准曲线，将 0、0.5、1.0、1.5、2 和2.5mL 滤液与1mL OPD 溶液混合，随后用流动相稀释至10mL。每天制作标准曲线以说明荧光响应的日常变化。在黑暗中孵育60min 后，通过具有荧光检测的HPLC 测定。

（5）制备12.5mgβ-胡萝卜素、17.5mg 反式-β-apo-80-胡萝卜素和1.0mg 叶黄素在100mL 氯仿中的储备溶液，储存在-18℃的琥珀色瓶。从储备溶液开始，制作工作标准，每周通过测量最大波长处的吸光度来检查浓度。为制备β-胡萝卜素、反式-β-apo-80-胡萝卜素和叶黄素的工作溶液，分别取400μL、400μL 和1mL，在N2 下蒸发。随后，β-胡萝卜素残基溶液在己烷中得到。

提取过程不包括皂化过程，因为主要的类胡萝卜素峰和内标峰与叶绿素峰分离。在分析过程中，通过用铝箔覆盖玻璃器皿来保护样品免受日光照射。将莴苣样品用手动搅拌器混合，然后在锥形瓶中对3g 生菜进行分析称重。加入反式-β-apo-80-胡萝卜醛作为内标物和35mL 乙醇/己烷后，将样品充分混合。

随后，在室温下在氮气下连续搅拌提取样品15min，将混合物在分液漏斗上过滤。折叠的过滤器用35mL 乙醇/己烷混合物洗涤，用12.5mL 乙醇洗涤2 次，最后用12.5mL 己烷洗涤，直到白色残余物留在过滤器上。然后，将滤液依次用10%氯化钠和水分别进行多次洗涤。在每个洗涤步骤之后，弃去水层。将含有类胡萝卜素的有机层在圆底烧瓶中用无水硫酸钠干燥并在40℃减压蒸发直至获得油树脂。然后，在氮气下蒸发树脂直至干燥。将残留物进行超声处理15s，并通过过滤器储藏在储存瓶中。

最后，在流动相中对类胡萝卜素提取物进行适当稀释，并立即进行HPLC 分析。不同类胡萝卜素通过它们的吸收光谱（最大吸收波长和光谱形状）和极性程度（与它们的洗脱时间相关）以及叶黄素和β-胡萝卜素的比较来识别与标准品的保留时间。为了量化那些没有商业标准的类胡萝卜素，叶黄素的响应因子用于叶黄素，而β-胡萝卜素的响应因子用于胡萝卜素。每个生菜样品中内标（反式胡萝卜素）的回收率均高于83%。

2 实验结果

以每100g 鲜重的微克数表示。抗氧化能力通过铁还原抗氧化能力技术测定，通过将25mg 添加到100mL 己烷中来制备储备溶液，溶液在-18℃避光保存。取4mL 体积并在氮气下蒸发。残余物10mL 甲醇重新溶解。随后，在292nm（E1%=76）处读取R-生育酚标准品和298nm（E1%=87）处的δ-生育酚标准品的吸光度读数。通过测量适当发射波长处的吸光度，每周检查生育酚的浓度。将样品混合，并在100mL 锥形瓶中分析称量5g 样品。随后，添加具有0.05%BHT 的50mL 己烷/乙醇（4:1，v/v）。δ-生育酚用作内标，因为卷心莴苣中不存在δ-生育酚。在室温下萃取15min 后，混合物在分液漏斗上过滤。

过滤器用25mL 己烷洗涤后，滤液用10mL 水洗涤2 次。有机层经硫酸钠干燥并在减压下及在50℃蒸发直至获得油树脂。此外，在氮气下蒸发油树脂直至干燥。将残余物用己烷重新溶解，通过小瓶中的0.45μm HPLC 过滤器过滤，并注入用于描述维生素C 测定程序的HPLC 系统中。生育酚（R-和δ-）通过将它们的保留时间和荧光光谱来鉴定。每个生菜样品中内标（δ-生育酚）的回收率均高于85%。

为了确定总酚含量，将分析称重的部分（5g）用50%甲醇水溶液稀释至50mL，在80℃下振摇2h，然后过滤。提取物一式三份进行，并在-20℃下最多储存24h。将适当体积（5mL）的滤液加入100mL 容量瓶中。6min 后加入15mL 的20%碳酸钠。用蒸馏水稀释至刻度并摇动，混合物在室温下避光反应2h。

抗氧化能力通过铁还原抗氧化能力技术测定。称取约5g均质卷心莴苣并在氮气下用20mL 乙醇/水萃取15min。随后，将混合物在10℃以5000g 离心15min，并保留上清液。重复提取过程并通过在10℃下以12000g 离心15min 完成。收集2 种上清液并用95%乙醇调节至50mL。最后，过滤上清液并在-80℃的氮气下储存。

FRAP 是通过监测在593nm 处由Fe3+- TPTZ 复合物在pH3.6 下还原为亚铁形式引起的吸光度变化而获得的。将100μL FRAP 试剂或醋酸盐缓冲液（空白）添加到样品或标准品中。在37℃的20min 内，每分钟测量一次吸光度。通过比较样品中的吸光度变化与从增加浓度的Fe3+获得的吸光度变化，获得FRAP 值。

所有吸光度读数均通过微孔板分光光度计使用微孔板管理器软件，结果表示为每100g 鲜重的Fe2+微摩尔数。

3 统计分析

对每种液体处理进行了3 次重复，以研究它们对初始微生物质量、类胡萝卜素和R-生育酚含量以及FRAP 抗氧化能力的影响，而进行2 次重复以评估它们对维生素C 和苯酚含量的影响。对于二氧化氯气体处理，从一批处理过的蔬菜中随机抽取三个样品。通过使用以下方法分析不同系列（对照、水（参考处理）、低浓度次氯酸钠、高浓度次氯酸钠）之间的微生物减少、颜色测量和养分含量的显著差异（P < 0.05），在3 个或更多重复可用且满足正态性和等方差条件的情况下进行方差分析（单向方差分析）。在存在显著差异的情况下，采用事后多重比较检验建立均值的多重比较。在非正态性或不等方差的情况下，使用非参数等价物。在18 名评估员的情况下，获得统计显著性（R=0.05）差异的正确响应的临界数量是10（25）。

4 结论

用水、含有4.5 和30mg L-1游离氯的中性、次氯酸钠（20和200mg L-1）与未清洗的生菜相比，用中性、200mg L-1次氯酸钠对莴苣进行消毒并与二氧化氯气体接触，微生物负荷显著减少，但高浓度的次氯酸钠可能会带来不同的缺点，例如可能形成有害的消毒副产物。从微生物的角度来看，用中性电解氧化水（30mg L-1）与气态二氧化氯接触对鲜切卷心莴苣最有效，而不会影响其感官品质。